ड्रोसोफिला लार्वा इमेजिनल डिस्क विच्छेदन: एपिथेलिया के विकास का निरीक्षण करने के लिए एक विधि

Overview

जब ड्रोसोफिला कल्पनाशील डिस्क धुंधला, अक्सर एक मोटा विच्छेदन किया जाता है जहां डिस्क उजागर कर रहे हैं, लेकिन शरीर से जुड़े रहते हैं । एक बार दाग, ब्याज की डिस्क अलग और घुड़सवार हैं । उदाहरण प्रोटोकॉल विंग कल्पनीय डिस्क विच्छेदन और बढ़ते के लिए एक प्रक्रिया को दर्शाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल मोरिमोटो और तमोरी, ड्रोसोफिला इमेजिनल डिस्क एपिथेलिया, जे विस एक्सपी (2017) में ट्यूमर के इंडक्शन और निदान का एक अंश है।

1. लार्वा का विच्छेदन

1. लकड़ी की छड़ी या कुंद संदंश के साथ तीसरे इंस्टार लार्वा को इकट्ठा करें, फ्लोरोसेंट मार्कर(जैसे,ईजीएफपी) द्वारा उन्हें फ्लोरेसेंस स्टीरियोस्कोप के तहत जीनोटाइप करें और उन्हें पीबीएस (फॉस्फेट बफर नमकीन) के साथ विच्छेदन पकवान में रखें।
2. पीबीएस में लार्वा को 2 एमएल प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट के साथ पिपटिंग करके धोएं।
3. लार्वा के केंद्र को एक संदंश के साथ पिंच करें और शरीर को अन्य संदंश के साथ आधे में फाड़ दें।
4. पूर्वकाल के मुंह के हुक को एक संदंश के साथ पिंच करें और शरीर को अंदर की ओर मोड़ने के लिए अन्य संदंश के साथ मुंह को शरीर की ओर धकेलें।
5. लार ग्रंथियों या वसा निकायों जैसे अनावश्यक सामग्रियों को संदंश के साथ हटा दें।

2. फिक्सेशन और एंटीबॉडी स्टेनिंग

1. लार्वा शरीर के विच्छेदित पूर्वकाल आधे (कल्पना विंग डिस्क सहित) को 1.5 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1 एमएल ऑफ फिक्स सॉल्यूशन (पीबीएस में 4% फॉर्मलडिहाइड) में कोमल रोटेशन के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए ठीक करें।
   सावधानी: फॉर्मेल्डिहाइड विषाक्त है और इसमें कैंसरजनक क्षमता है। त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें।
   नोट: इस हिस्से में, सभी कदम अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक नटेटर पर होते हैं जब तक कि अन्यथा नोट न हो।
2. फिक्स समाधान निकालें और त्यागें। ऊतकों को पीबीटी के 1 एमएल (पीबीएस में 0.3% ट्राइटन एक्स-100) के साथ 15 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
3. पीबीटी निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर कमरे के तापमान पर या रात भर में अवरुद्ध और अखरोट 1 घंटे के लिए पीबीटीजी (0.2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन और पीबीटी में 5% सामान्य बकरी सीरम) के 1 मिलीएल जोड़ें।
4. पीबीटीजी निकालें और पीबीटीजी (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ उचित रूप से पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर अखरोट।
5. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और ऊतकों को 15 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार 1 एमएल पीबीटी से धोएं।
6. पीबीटी निकालें और पीबीटीजी (1:400) के साथ उचित रूप से पतला माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए नाता।
7. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार पीबीटी के 1 एमएल के साथ ऊतकों को धोएं।
8. एफ-ऐक्टिन को दाग देने के लिए, पीबीटी को हटा दें और पीबीएस (1:40) में उचित रूप से पतला होकर फालॉइडिन समाधान जोड़ें। फिर 20 मिनट के लिए अखरोट। फालॉइडिन समाधान निकालें और ऊतकों को पीबीटी के 1 एमएल से दो बार 15 मिनट के लिए धोएं।
9. परमाणु डीएनए का मुकाबला करने के लिए, पीबीटी को हटा दें और डीएपीआई (4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडल) समाधान (पीबीएस में DAPI के 0.5 μg/mL) जोड़ें। फिर 10 मिनट अखरोट।
   सावधानी: डीएपीआई में कैंसरजनक क्षमता है। त्वचा के संपर्क को रोकने के लिए सुरक्षात्मक दस्ताने और कपड़े पहनें।
10. DAPI समाधान निकालें और 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार पीबीटी के 1 एमएल के साथ ऊतकों को धोएं।
11. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के 1 एमएल में एक बार कुल्ला।
12. पीबीएस निकालें और पूर्व-बढ़ते माध्यम के रूप में 100% ग्लाइसरोल के 500 माइक्रोन जोड़ें।

3. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते

1. दाग वाले ऊतकों को 2 मिलीएल प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
2. ऊतकों को संदंश के साथ एक और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते माध्यम की बूंदों में स्थानांतरित करें।
3. एक संदंश के साथ विच्छेदित ऊतक के अंत को पकड़ें और अन्य संदंश के साथ मस्तिष्क और आंख एंटीनाल डिस्क को दूर करें।
   नोट: विच्छेदन दिमाग उन्हें पंख कल्पना डिस्क के पास रखने के लिए रखें। दिमाग एक मंच के रूप में कार्य करता है जो कवरस्लिप को विंग कल्पनीय डिस्क को कुचलने से रोकता है।
4. पंख कल्पना डिस्क को अलग करने के लिए एक संदंश के साथ विच्छेदित ऊतक के अंत को पकड़ ते हैं और धीरे-धीरे शरीर की दीवार को खरोंच करते हैं और अन्य संदंश के साथ डिस्क को फाड़ देते हैं।
   नोट: यदि विंग कल्पनीय डिस्क ढूंढना मुश्किल है, तो श्वासनली को पीछे से पूर्वकाल की ओर छीलें। विंग कल्पनाशील डिस्क श्वासनली से चिपक जाते हैं।
5. धीरे-धीरे नेल पॉलिश के साथ एक कवरस्लिप और सील के साथ कल्पना डिस्क को कवर करें; 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap