Drosofilia Dissezione del disco imaginale larvale: un metodo per osservare l'epitelia in via di sviluppo

Overview

Quando si macchiano dischi imaginali Drosophila, spesso viene eseguita una dissezione ruvida dove i dischi sono esposti ma rimangono attaccati al corpo. Una volta macchiati, i dischi di interesse sono isolati e montati. Il protocollo di esempio illustra una procedura per la dissezione e il montaggio del disco imaginale alare.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Morimoto e Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp.

1. Dissezione delle larve

1. Raccogliere le terze larve instar errante con un bastoncino di legno o forcep smussate, genotiparlecon appositamarcatori fluorescenti (ad esempio , EGFP) sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza e metterli in una piastra di dissezione con PBS (soluzione salina tamponata di fosfato).
2. Lavare le larve in PBS pipettando con pipette di trasferimento in plastica da 2 mL.
3. Pizzicare il centro della larva con una forza e strappare il corpo a metà con le altre forcep.
4. Pizzicare il gancio della bocca della metà anteriore con una forza e spingere la bocca verso il corpo con le altre flessori per capovolgire il corpo.
5. Rimuovere materiali non necessari come ghiandole salivari o corpi grassi con forcep.

2. Fissazione e colorazione degli anticorpi

1. Trasferire la metà anteriore sezionata del corpo larvale (compresi i dischi delle ali immaginarie) su un tubo di plastica da 1,5 ml e fissarlo in 1 ml di soluzione Fix (4% di formaldeide in PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con rotazione delicata.
   ATTENZIONE: La formaldeide è tossica e ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per prevenire il contatto con la pelle.
   NOTA: In questa parte, tutte le misure si svolgono su un nutator a temperatura ambiente al buio, salvo diversa indicazione.
2. Rimuovere la soluzione Fix ed eliminare. Lavare i tessuti con 1 mL di PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) tre volte per 15 minuti ciascuno.
3. Rimuovere il PBT e aggiungere 1 mL di PBTG (albumina di siero bovino allo 0,2% e siero di capra normale al 5% in PBT) per bloccare e nutare 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
4. Rimuovere pbtg e aggiungere la soluzione di anticorpi primari opportunamente diluita con PBTG (vedi Tabella dei materiali) e nutato durante la notte a 4 °C.
5. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i tessuti con 1 mL PBT tre volte per 15 minuti ciascuno.
6. Rimuovere il PBT e aggiungere la soluzione di anticorpi secondari opportunamente diluita con PBTG (1:400). Nutato per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
7. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i tessuti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
8. Per macchiare F-actin, rimuovere PBT e aggiungere la soluzione di Phalloidin opportunamente diluita in PBS (1:40). Quindi nutate per 20 minuti. Rimuovere la soluzione di phalloidina e lavare i tessuti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
9. Per controsostenere il DNA nucleare, rimuovere il PBT e aggiungere la soluzione DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindolo) (0,5 μg/mL di DAPI in PBS). Quindi nutate 10 min.
   ATTENZIONE: Dapi ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per prevenire il contatto con la pelle.
10. Rimuovere la soluzione DAPI e lavare i tessuti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
11. Risciacquare una volta in 1 mL di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
12. Rimuovere il PBS e aggiungere 500 μL di glicerolo al 100% come mezzo di pre-montaggio.

3. Montaggio su vetrini al microscopio

1. Posizionare i tessuti macchiati su uno scivolo al microscopio utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da 2 mL.
2. Trasferire i tessuti a gocce di mezzo di montaggio su un altro vetrino del microscopio con forcelle.
3. Tenere premuto l'estremità del tessuto sezionato con una forza e tirare via i dischi antenne cerebrali e oculari con le altre forcelle.
   NOTA: Tieni i cervelli sezionati per posizionarli vicino ai dischi immaginabili dell'ala. Il cervello agisce come una piattaforma che impedisce al coverslip di schiacciare i dischi immaginari dell'ala.
4. Per isolare i dischi immaginari dell'ala tenere premuta l'estremità del tessuto sezionato con una forza e graffiare delicatamente la parete del corpo e strappare i dischi con le altre forcelle.
   NOTA: Se è difficile trovare dischi imaginali alati, sbucciare la trachea dal lato posteriore a quello anteriore. I dischi immaginazionali delle ali si attaccano alla trachea.
5. Coprire delicatamente i dischi immaginari con un coprisciuggine e sigillare con smalto per unghie; conservare a 4 °C.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap