Drosophila (olika betydelser) Larva Imaginal Disc Dissekering: En metod för att observera utvecklande epitel

Overview

Vid färgning av Drosophila imaginala skivor utförs ofta en grov dissekering där skivorna exponeras men förblir fästa vid kroppen. När de är färgade isoleras och monteras skivorna av intresse. Exempelprotokollet visar en procedur för dissekering och montering av vingemaginala skivor.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Morimoto och Tamori, induktion och diagnos av tumörer i Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Dissekering av larver

1. Samla vandrande tredje instar larver med en träpinne eller trubbiga tång, genotyp dem genom lämpliga fluorescerande markörer(t.ex.EGFP) under ett fluorescens stereoskopiskt mikroskop och placera dem i en dissekeringsform med PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
2. Tvätta larverna i PBS genom pipettering med 2 ml plastöverföringspipetter.
3. Nyp larvens centrum med en tång och riv kroppen i hälften med de andra tångarna.
4. Nyp munkroken på den främre halvan med en tång och tryck munnen mot kroppen med de andra tångarna för att vända kroppen ut och in.
5. Ta bort onödiga material som salivkörtlar eller fettkroppar med tång.

2. Fixering och antikroppsfärgning

1. Överför den dissekerade främre halvan av larvkroppen (inklusive imaginala vingskivor) till ett 1,5 ml plaströr och fixera i 1 ml Fix-lösning (4% formaldehyd i PBS) i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret med mild rotation.
   VARNING: Formaldehyd är giftigt och har cancerframkallande potential. Använd skyddshandskar och kläder för att förhindra hudkontakt.
   OBS: I den här delen sker alla steg på en mutter vid rumstemperatur i mörkret om inget annat anges.
2. Ta bort Fix-lösningen och kassera. Tvätta vävnaderna med 1 ml PBT (0,3% Triton X-100 i PBS) tre gånger i 15 min vardera.
3. Ta bort PBT och tillsätt 1 ml PBTG (0,2% bovint serumalbumin och 5% normalt getserum i PBT) för blockering och mutter 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
4. Ta bort PBTG och tillsätt primär antikroppslösning som är lämpligt utspädd med PBTG (se materialförteckning)och mutter över natten vid 4 °C.
5. Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT tre gånger i 15 minuter vardera.
6. Ta bort PBT och tillsätt sekundär antikroppslösning på lämpligt sätt utspädd med PBTG (1:400). Nöta i 2 timmar vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
7. Ta bort sekundär antikroppslösning och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT två gånger i 15 minuter vardera.
8. För att färga F-aktin, ta bort PBT och tillsätt Phalloidin lösning lämpligt utspädd i PBS (1:40). Nöta sedan i 20 min. Ta bort Phalloidin-lösningen och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT två gånger i 15 minuter vardera.
9. För att motverka nukleärt DNA, ta bort PBT och tillsätt DAPI(4', 6-diamidino-2-fenylindol) lösning (0,5 μg/ml DAPI i PBS). Nöta sedan 10 min.
   VARNING: DAPI har cancerframkallande potential. Använd skyddshandskar och kläder för att förhindra hudkontakt.
10. Ta bort DAPI-lösningen och tvätta vävnaderna med 1 ml PBT två gånger i 15 minuter vardera.
11. Skölj en gång i 1 ml PBS i 10 min vid rumstemperatur.
12. Ta bort PBS och tillsätt 500 μL 100 % glycerol som förmonteringsmedium.

3. Montering på mikroskopbilder

1. Placera de färgade vävnaderna på en mikroskoprutschbana med en 2 ml plastöverföringspipett.
2. Överför vävnaderna till droppar av monteringsmedium på en annan mikroskopbild med tång.
3. Håll ner änden av dissekerad vävnad med en tång och dra bort hjärn- och ögonantennskivor med de andra tångarna.
   OBS: Håll de dissekerade hjärnorna för att placera dem nära vingemaginala skivor. Hjärnorna fungerar som en plattform som hindrar täcket från att krossa vinge imaginala skivor.
4. För att isolera vingens imaginala skivor håll ner änden av dissekerad vävnad med en tång och skrapa försiktigt kroppsväggen och riva av skivorna med de andra tångarna.
   OBS: Om det är svårt att hitta vinge imaginala skivor, skala luftstrupen från den bakre till den främre sidan. Vinge imaginala skivor håller sig till luftstrupen.
5. Täck försiktigt de imaginala skivorna med ett täckglas och försegla med nagellack; förvaras vid 4 °C.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap