Drosophila Disección del disco larva imaginal: un método para observar el desarrollo de la epitelelia

Overview

Al manchar discos imaginales de Drosophila, a menudo se realiza una disección aproximada donde los discos están expuestos pero permanecen unidos al cuerpo. Una vez manchados, los discos de interés se aíslan y montan. El protocolo de ejemplo muestra un procedimiento para la disección y montaje del disco imaginal de las alas.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Morimoto y Tamori, Inducción y Diagnóstico de Tumores en Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Disección de larvas

1. Recoger larvas de tercera estrella errante con un palo de madera o fórceps contundentes, genotipo de ellos por marcadores fluorescentes apropiados(por ejemplo,EGFP) bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia y colocarlos en un plato de disección con PBS (solución salina tamponada de fosfato).
2. Lave las larvas en PBS pipeteando con pipetas de transferencia de plástico de 2 ml.
3. Pellizcar el centro de la larva con un fórceps y rasgar el cuerpo por la mitad con los otros fórceps.
4. Pellizque el gancho de la boca de la mitad anterior con un fórceps y empuje la boca hacia el cuerpo con los otros fórceps para girar el cuerpo de adentro hacia afuera.
5. Retire materiales innecesarios como glándulas salivales o cuerpos grasos con fórceps.

2. Fijación y tinción de anticuerpos

1. Transfiera la mitad anterior diseccionada del cuerpo larvario (incluidos los discos de ala imaginal) a un tubo de plástico de 1,5 ml y fije en 1 ml de solución Fix (4% formaldehído en PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con rotación suave.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y tiene potencial cancerígeno. Use guantes y ropa de protección para evitar el contacto con la piel.
   NOTA: En esta parte, todos los pasos tienen lugar en un nutator a temperatura ambiente en la oscuridad a menos que se indique lo contrario.
2. Quite la solución Fix y descarte. Lave los tejidos con 1 ml de PBT (0,3% Tritón X-100 en PBS) tres veces durante 15 minutos cada uno.
3. Retire el PBT y agregue 1 ml de PBTG (0,2% albúmina sérica bovina y 5% sérica de cabra normal en PBT) para bloquear y nuezar 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
4. Retire PBTG y agregue la solución de anticuerpos primarios adecuadamente diluida con PBTG (ver Tabla de Materiales)y enrarece durante la noche a 4 °C.
5. Retire la solución de anticuerpos primarios y lave los tejidos con 1 mL PBT tres veces durante 15 minutos cada uno.
6. Retire PBT y agregue la solución secundaria de anticuerpos diluida adecuadamente con PBTG (1:400). Nutate para 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
7. Retire la solución secundaria de anticuerpos y lave los tejidos con 1 ml de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
8. Para manchar F-actin, retire PBT y agregue la solución de faloidina adecuadamente diluida en PBS (1:40). Luego enloquece durante 20 minutos. Retire la solución de faloidesina y lave los tejidos con 1 ml de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
9. Para contrarrestar el ADN nuclear, retire PBT y añada dapi (4', 6-diamidino-2-phenylindole) solución (0,5 μg/ml de DAPI en PBS). Luego enloquece 10 min.
   PRECAUCIÓN: DAPI tiene potencial cancerígeno. Use guantes y ropa de protección para evitar el contacto con la piel.
10. Retire la solución DAPI y lave los tejidos con 1 ml de PBT dos veces durante 15 minutos cada uno.
11. Enjuague una vez en 1 ml de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
12. Retire PBS y agregue 500 μL de 100 % de glicerol como medio de pre-montaje.

3. Montaje en diapositivas de microscopio

1. Coloque los tejidos manchados en una diapositiva del microscopio con una pipeta de transferencia de plástico de 2 ml.
2. Transfiera los tejidos a gotas de medio de montaje en otra diapositiva del microscopio con fórceps.
3. Mantenga pulsado el extremo del tejido diseccionado con un fórceps y tire de los discos de antenas cerebrales y oculares con los otros fórceps.
   NOTA: Mantenga los cerebros diseccionados para colocarlos cerca de los discos imaginales del ala. Los cerebros actúan como una plataforma que impide que el deslizamiento de cubierta aplaste los discos imaginativos del ala.
4. Para aislar los discos imaginales del ala, mantenga pulsado el extremo del tejido diseccionado con un fórceps y rasque suavemente la pared del cuerpo y rompa los discos con los otros fórceps.
   NOTA: Si es difícil encontrar discos imaginales de ala, pelar la tráquea desde la parte posterior hasta el lado anterior. Los discos imaginales del ala se adhieren a la tráquea.
5. Cubra suavemente los discos imaginales con un coverlip y selle con esmalte de uñas; tienda a 4 °C.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Phosphate buffered saline (PBS)	Wako	162-19321
TritonX-100	Wako	168-11805
Formaldehyde	Wako	064-00406
bovine serum albumin	Sigma	A7906
normal goat serum	Sigma	G6767
mounting medium, Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Sigma	D9542
mouse-anti-Dlg 4F3	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203	dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3A6B4, RRID:AB_579780	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	3B8D12, RRID:AB_579781	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1	Developmental Studies Hybridoma Bank	5H7B11, RRID:AB_579779	3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	AA4.3, RRID:AB_579793	dilute in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Molecular probes	A22283	dilute in PBS, 1:40
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546	Molecular probes	A11030	dilute in PBTG, 1:400
Fly strains
sd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#8609	recombined with UAS-EGFP
upd-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	#26796	recombined with UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#51247
UAS-scrib-RNAi	Vienna Drosophila RNAi center	#105412
UAS-RasV12	Bloomington Drosophila Stock Center	#64196
UAS-Yki3SA	Bloomington Drosophila Stock Center	#28817
hsFLP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	#4780	recombined with UAS-EGFP
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#5428	X chromosome
UAS-EGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	#6658	third chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24650	second chromosome
UAS-Dicer2	Bloomington Drosophila Stock Center	#24651	third chromosome
vkg-GFP	Morin et al. 2001		GFP protein trap