Overview
यह लेख एक मादा ड्रोसोफिला फ्लाई से पूर्वकाल माल्पिगियन ट्यूबल्स (एमटी) के विच्छेदन और रोसानो एट अलसे एक उदाहरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। (2017) जिसमें एमटीएस को परफ्यूजन चैंबर में लाइव इमेजिंग के लिए तैयार किया जाता है।
Protocol
यह प्रोटोकॉल रोसानो और रोमेरो का एक अंश है, जो ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर माल्पिगियन ट्यूबुल एपिथेलिया में इंट्रासेलुलर पीएच का ऑप्टिकल क्वांटिफिकेशन है, जिसमें फ्लोरोसेंट जेनेटिकली-एन्कोडेड पीएच इंडिकेटर, जे विस एक्सपी (2017)।
1. पॉली-एल-लिसिन स्लाइड की तैयारी
- मानक 75 x 25 मिमी स्लाइड के शीर्ष के चारों ओर हाइड्रोफोबिक पीएपी पेन के साथ 40 x 20 मिमी सीमा ड्रा करें और आरटी में 15 मिनट के लिए सूखने के लिए अलग सेट करें। यदि स्लाइड इमेजिंग ऑप्टिक्स के साथ संगत नहीं हैं तो बड़े कवरस्लिप का उपयोग करें।
- स्टॉक के 2 एमएल 0.01% पॉली-एल-Lysine (PLL) समाधान प्रत्येक स्लाइड पर स्थानांतरित करें और आरटी में 1 घंटे के लिए अलग सेट करें।
- एक पिपेट के साथ अतिरिक्त पीएलएल निकालें। भविष्य के उपयोग के लिए 50 एमएल शंकुशीली शीशी में समाधान को बचाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- वैक्यूम लाइन के साथ किसी भी शेष समाधान को एस्पिरेट करें। स्लाइड सतह पर वैक्यूम लाइन चलाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्लाइड पर कोई समाधान न रहे।
- उपयोग करने से पहले आरटी में 1 अतिरिक्त एच के लिए स्लाइड्स को अलग सेट करें। स्लाइड्स को एक स्टैंडर्ड स्लाइड बुक में 1 महीने तक आरटी पर ड्राई स्टोर करें ।
2. विच्छेदन पकवान और ग्लास रॉड की तैयारी
- 5 मिमी की गहराई का उत्पादन करने के लिए आरटी में 35 x 10 मिमी पॉलीस्टीरिन पेट्री डिश में इलास्टोमर इलाज एजेंट के 4.5 एमएल में इलास्टोमर बेस जोड़ें। डिस्पोजेबल पिपेट टिप के साथ मिलाएं। एलाटोमर को आरटी में O/N का इलाज करने की अनुमति दें ।
नोट: इलास्टोमर स्पष्ट और बुलबुले से मुक्त होना चाहिए। बुलबुले के समाशोधन को डालने के बाद 10-15 मिनट के लिए वैक्यूम जार में इलास्टोमर प्लेटों को रखकर सुविधा प्रदान की जा सकती है। - हाथों के बीच 5 मिमी व्यास की कांच की छड़ पकड़ो और सिरों को अलग करते हुए एक जलाया बुनसेन बर्नर पर रॉड के केंद्र को पिघलाएं। के रूप में कांच पिघला देता है और अधिक तेजी से खींचने के लिए एक पतली (०.१ मिमी) और पतला शाफ्ट(चित्रा 1)का उत्पादन ।
नोट: टांग पर एक 45 डिग्री कोण अक्सर ट्यूबलों को संभालने में सहायक होता है। यह एक हाथ को कम करके प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि टांग खींच ली जाती है (चित्र 1देखें)। - एक धार कार्बन स्टील रेजर ब्लेड के कुंद पक्ष के साथ बीच में पतली शाफ्ट तोड़ें। ब्रेक को साफ करने के लिए एक विच्छेदन गुंजाइश के तहत रॉड के पतले अंत का निरीक्षण करें।
3. वयस्क ड्रोसोफिला पूर्वकाल मालपिगियन ट्यूबल्स का विच्छेदन
- विच्छेदन पकवान इकट्ठा और धारा 2 से कांच की छड़ खींच लिया, धारा 1 से एक PLL-लेपित स्लाइड, एक चिपकने वाला प्रसार-अच्छी तरह से डिवाइडर, वैक्यूम तेल, सीलिंग फिल्म की एक 4 x 2 "पट्टी, #5 ठीक संदंश के 2 जोड़े, और बर्फ के ४० एमएलए aliquots ठंड श्नाइडर मध्यम और आरटी iPBS ।
- सीलिंग टेप पर वैक्यूम तेल फैलाएं और चिपकने वाले पर्फ्यूजन-वेल डिवाइडर को टेप पर दबाएं ताकि तेल के साथ नीचे कोट किया जा सके। चिपकने वाला पर्फ्यूजन-वेल डिवाइडर से छील लें और इसे एक पीएलएल लेपित स्लाइड के शीर्ष पर तेल-साइड-डाउन रखें। हाइड्रोफोबिक तेल में पता लगाया व्यक्तिगत नमूना कुओं को छोड़ने के लिए परफ्यूजन-वेल डिवाइडर निकालें।
- तेल में आरटी iPBS के 200 μL प्लेस-PLL लेपित स्लाइड पर अच्छी तरह से घेर लिया और स्टीरियोस्कोप के नीचे स्लाइड ले जाएँ।
- यूएएस-pHerry/capaR-GAL4 एक खाली मक्खी शीशी में मक्खियों प्लेस और उन्हें 10 मिनट के लिए बर्फ पर anesthetize ।
नोट: एनेस्थीसिया की यह विधि, सीओ2के विपरीत, यह सुनिश्चित करती है कि मक्खियां निर्जलित न होएं। - विच्छेदन पकवान में बर्फ-ठंडे श्नाइडर के माध्यम डालें और एक विच्छेदन स्टीरियोस्कोप के तहत पकवान में एक एकल एनेस्थेटाइज्ड मादा फ्लाई को स्थानांतरित करने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।
- संप से छाती के साथ फ्लाई को पकड़ें और पेट के पीछे धीरे-धीरे पकड़ने के लिए दूसरे का उपयोग करें। छोटी, जानबूझकर गति में संदंश का उपयोग कर मक्खी के पीछे खुला खींचो। एक बार हिंडगट दिखाई देता है, डिस्टल एंड पकड़ें और बीटिंग, संक्षिप्त टग के माध्यम से हिंडगट को शरीर से दूर खींचकर अंतर्निहित ट्रेकोल से आंत और एमटीएस को मुक्त करें।
नोट: पूर्वकाल और पीछे के मीटर दिखाई देंगे जहां वे यूरेटर के माध्यम से मिडगुट और हिंडगट के जंक्शन से मिलते हैं। मुक्त होने के लिए एमटीएस की पहली जोड़ी की संभावना पीछे के ट्यूबल होंगे क्योंकि वे हिंडगट को घेरते हैं। इन्हें नजरअंदाज किया जासकता है (चित्रा 2ए)। - एक बार मीटर का दूसरा सेट पेट से मुक्त होने के बाद ठीक संदंश के साथ मूत्रवर्धक पर पूर्वकाल एमटीएस को बंद कर दें। यह पूर्वकाल के मीटर को आंत से अलग करेगा और मूत्रालय को बंद कर देगा।
- यूरेटर के नीचे रॉड फिसलने से खींची गई ग्लास रॉड के साथ मुफ्त पूर्वकाल एमटीएस उठाएं जैसे कि ट्यूबल दोनों तरफ गिर जाते हैं। एमटीएस को सीधे समाधान से बाहर उठाएं।
- कांच की छड़ को इस तरह घुमाएं कि मीटर और यूटर को रॉड के नीचे का पालन किया जाए और यूरेटर को सीधे स्लाइड पर कम करें। यूरेटर को प्रत्यय करें और ग्लास स्लाइड(चित्रा 2बी)पर मूत्रवर्धक को दबाकर एमटीएस के डिस्टल सिरों को सील करें। जरूरत से ज्यादा एमटीएस में हेराफेरी न करें। मीटर को स्लाइड करने के लिए लंगर डाले हुए मूत्रवर्धक के साथ समाधान में तैरना चाहिए।
- स्लाइड सतह के पार प्रत्येक ट्यूबल को धीरे-धीरे स्वीप करने के लिए ग्लास रॉड के ठीक अंत का उपयोग करें। ट्यूबल को कुचलने से बचने के लिए स्लाइड के खिलाफ रॉड को संभालो और ट्यूबल के शीर्ष पर रॉड स्लाइड करें, समीपस्थ तक ले जा रहे हैं, प्रत्येक ट्यूबल की पूरी लंबाई को पीएलएल-लेपित स्लाइड(चित्रा 2सी)की सतह पर संलग्न करने के लिए।
- चिपकने वाला पर्फ्यूजन-वेल डिवाइडर को स्लाइड पर वापस रखें ताकि घुड़सवार ट्यूबल पर एक छोटा सा तरल पदार्थ भरा हुआ हो।
- नमूना माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। इन्फ्लो और आउटफ्लो केशिकाओं को क्रमशः परफ्यूजन के इनलेट और आउटलेट ओपनिंग पर रखें।
नोट: यदि एक खुला परफ्यूजन कक्ष वांछित है तो अच्छी तरह से डिवाइडर को छोड़ा जा सकता है। इस मामले में अंतर्वाह और बहिर्वाह केशिकाओं को इमेजिंग के विपरीत पक्षों के साथ अच्छी तरह से गठबंधन किया जा सकता है।
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Representative Results
चित्रा 1: मालपिगियन ट्यूबल से निपटने के लिए ग्लास रॉड गढ़ना।
ए - ई. मीटर से निपटने के लिए उपयुक्त टेपर और कोण का उत्पादन करने के लिए कांच की छड़ को गर्म करने और खींचने की प्रक्रिया। तीर लागू किए जाने वाले बल की दिशा और परिमाण को निरूपित करता है। F.एक उचित निर्मित ग्लास उपकरण की तस्वीर। स्केल बार = 10 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: वयस्क ड्रोसोफिला पूर्वकाल मालपिगियन ट्यूबल्स का विच्छेदन।
ठंडा श्नाइडर के माध्यम में ठीक संदंश के 2 जोड़े के साथ पूर्वकाल मीट्रिक टन हटाने का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । "ए ट्यूबल" = पूर्वकाल मीट्रिक टन "पी ट्यूबल" = पीछे एमटी बी। पतली कांच की छड़ का उपयोग करके निकाले गए एमटीएस को पुनः प्राप्त करने और बढ़ते की प्रक्रिया। Cइमेजिंग और फिजियोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एक स्लाइड के लिए निकाले गए MTs की पूरी लंबाई का पालन करने की प्रक्रिया । D.SEpH के प्रतिनिधि वाइडफील्ड छवियां (470/510 एनएम पूर्व/em) और mCherry (556/630 एनएम पूर्व/em) UAS के घटक-pHerry capaR-GAL4 द्वारा संचालित स्वस्थ पूर्वकाल MTs चित्रण, पूर्ववर्ती एमटीएस अपर्याप्त परफ्यूजन से क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, और पीछे के एमटीएस की गलत पहचान करते हैं। ध्यान दें कि स्वस्थ पूर्वकाल एमटीएस एक स्पष्ट फैला हुआ अंधा प्रारंभिक खंड प्रदर्शित करता है, जो कैपाआर-GAL4और एक डिस्टल मुख्य सेगमेंट द्वारा संचालित यूएएस-पीहरी की अपेक्षाकृत बढ़ी हुई अभिव्यक्ति के साथ एक संकुचित संक्रमणकालीन खंड है। क्षतिग्रस्त एमटीएस कोई संबंधित SEpH फ्लोरेसेंस के साथ mCherry फ्लोरेसेंस के ध्यान देने योग्य समुच्चय प्रदर्शित करता है। पीछे के मीटर व्यास में एक समान होते हैं जिसमें कोई रूपात्मक रूप से अलग सेगमेंट नहीं होते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-Lysine (PLL) Solution | Sigma-Aldrich | P4832 | Store at 4 °C, can be reused. |
| Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Available from multiple vendors. |
| Helping Hands Soldering Stands | Harbor Freight Tools | 60501 | Available from multiple vendors. |
| Schneider's Medium | Fisher Scientific | 21720024 | Store at 4 °C in sterile aliquots. |
| #5 Inox Steel Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Can be substituted based on experimenter comfort. |
| 35 x 10 mm polystyrene Petri dish | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | Exact brand and size are unimportant. |
| 75 x 25 mm Microscope Slides | Corning Life Sciences | 2949-75X25 | Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible. |
| Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells. |
| Vacuum Silicone Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Available from multiple vendors. |
| Glass rods, 5 mm diameter | delphiglass.com | 9198 | Exact size is personal preference, multiple vendors available |
| PAP Hydrophobic Pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Available from multiple vendors. |
| Sealing Film | Sigma-Aldrich | P7668 | Available from multiple vendors. |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | Available from multiple vendors. |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | Available from multiple vendors. |
| Dissecting Stereoscope | Zeiss | Discovery.V8 | Any dissecting stereoscope can be used. |
| UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Rossano et al., 2017 | |
| capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Terhzaz et al., 2012 | |
| c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Sozen et al., 1997 | |
| Single-edged Carbon Steel Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 71960 | Available from multiple vendors. |
| Microscopy Slide Folder | Fisher Scientific | 16-04 | Available from multiple vendors. |
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Available from multiple vendors. |
| Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Comparable items can be substituted. |
| 2.5 L Laboratory Ice Bucket | Fisher Scientific | 07-210-129 | Available from multiple vendors. |
| 200 uL barrier pipette tips | MidSci | AV200 | Available from multiple vendors. |
| 200 μL variable volume pipette | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Available from multiple vendors. |
