Malpighian Tubule Disseksjon fra en voksen fly: Isolere en Osmoregulatory og Excretory Organ

Overview

Denne artikkelen beskriver disseksjonen av de fremre malpighiske tubuliene (MT) fra en kvinnelig Drosophila-flue og en eksempelprotokoll fra Rossano et al. (2017) der MT-ene er klargjort for levende avbildning i et perfusjonskammer.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Rossano og Romero, optisk kvantifisering av intracellulær pH i Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia med en fluorescerende genetisk kodet pH-indikator, J. Vis. Exp. (2017).

1. Forberedelse av Poly-L-Lysine Lysbilder

1. Tegn en kant på 40 x 20 mm med en hydrofob PAP-penn rundt toppen av standard 75 x 25 mm lysbilder og sett til side for å tørke i 15 minutter på RT. Bruk store deksler hvis lysbildene ikke er kompatible med bildeoptikk.
2. Overfør 2 ml lager 0,01% Poly-L-Lysine (PLL) løsning på hvert lysbilde og sett til side for 1 t ved RT.
3. Fjern overflødig PLL med en pipette. Lagre løsningen i et 50 ml konisk hetteglass for fremtidig bruk. Oppbevars ved 4 °C.
4. Aspirer eventuell gjenværende løsning med en vakuumledning. Kjør vakuumledningen over hele glideflaten for å sikre at det ikke er noen løsning igjen på lysbildene.
5. Sett lysbildene til side i 1 ekstra t ved RT før bruk. Oppbevar lysbildene tørre på RT i opptil 1 måned i en standard lysbildebok.

2. Tilberedning av dissekeringsfat og glassstenger

1. Tilsett 0,5 ml elastomer herdemiddel til 4,5 ml elastomerbase i en 35 x 10 mm polystyren Petri-tallerken på RT for å produsere en dybde på 5 mm. Bland med en pipettespiss til engangsbruk. La elastomer kurere O/N ved RT.
   MERK: Elastomer skal være klar og fri for bobler. Rydding av bobler kan forenkles ved å holde elastomerplater i en vakuumburk i 10 - 15 minutter etter helling.
2. Hold en glassstang med en diameter på 5 mm mellom hender og smelt midten av stangen over en tent Bunsen-brenner mens du trekker endene fra hverandre. Etter hvert som glasset smelter, trekker du raskere for å produsere en tynn (0,1 mm) og konisk aksel (figur 1).
   MERK: En vinkel på 45 ° ved skaftet er ofte nyttig i håndtering av tubuli. Dette kan oppnås ved å senke den ene hånden når skaftet trekkes (se figur 1).
3. Bryt den tynne akselen i midten med den stumpe siden av et barberblad av karbonstål med én kant. Inspiser den tynne enden av stangen under et dissekeringsomfang for å sikre at pausen er ren.

3. Disseksjon av voksne Drosophila Anterior Malpighian Tubules

1. Samle disseksjonsfatet og trukket glassstang fra seksjon 2, en PLL-belagt sklie fra seksjon 1, en selvklebende perfusjonsbrønndeler, vakuumfett, en 4 x 2" stripe med tetningsfilm, 2 par #5 fine tang og 40 ml aliquots av iskald Schneiders medium og RT iPBS.
2. Spre vakuumfett på tetningsbåndet og trykk den selvklebende perfusjonsbrønndeleren på båndet for å belegge bunnen med fett. Skrell av den selvklebende perfusjonsbrønndeleren og legg den fett-side-ned på toppen av en PLL-belagt lysbilde. Fjern perfusjonsbrønndeleren for å etterlate individuelle prøvebrønner sporet i hydrofobt fett.
3. Plasser 200 μL RT iPBS i den fettomkransede brønnen på den PLL-belagte sklien og flytt lysbildet under stereoskopet.
4. Plasser UAS-pHerry/capaR-GAL4 fluer i et tomt fluehette hetteglass og bedøv dem på is i 10 minutter.
   MERK: Denne anestesimetoden, i motsetning til CO₂, sikrer at fluene ikke dehydrerer.
5. Hell iskald Schneiders medium i dissekeringsfatet og bruk fine tang til å overføre en enkelt bedøvet kvinne som flyr inn i parabolen under et dissekerende stereoskop.
6. Hold flyet ved thoraxen med et sett tang og bruk den andre til å forsiktig gripe bakre i magen. Trekk opp plakaten på flyet ved hjelp av tangene i korte, bevisste bevegelser. Når bakenden er synlig, ta tak i den distale enden og frigjør tarmen og MT-ene fra de underliggende trakeolene ved å trekke bakguten bort fra kroppen gjennom repeterende, korte slepebåter.
   MERK: De fremre og bakre MTene vil være synlige der de møter krysset mellom midgut og bakgut gjennom urinlederen. Det første paret med MT-er som er gratis, vil sannsynligvis være bakre tubuli når de omkranser baken. Disse kan ignoreres (Figur 2A).
7. Klem av de fremre MTene på urinlederen med fine tang når det andre settet med MTs er fri for magen. Dette vil skille de fremre MTene fra tarmen og lukke urinlederen.
8. Plukk opp de frie fremre MTene med den trukket glassstangen ved å skyve stangen under urinlederen slik at tubuliene faller til hver side. Løft MT-ene rett opp av oppløsningen.
9. Vri glassstangen slik at MT-ene og urinlederen festes til undersiden av stangen og senk urinlederen rett ned på lysbildet. Fest urinlederen og forsegle de distale endene av MTene ved å trykke urinlederen ned på glasssklie (Figur 2B). Ikke manipuler MTene mer enn nødvendig. MTene skal flyte opp i løsningen med urinlederen forankret til lysbildet.
10. Bruk den fine enden av glassstangen til forsiktig å feie hver tubule over glideflaten. Fest stangen mot gliden for å unngå å knuse tubule og skyv stangen over toppen av tubule, flytt distal til proksimal, for å feste hele lengden på hver tubule til overflaten av den PLL-belagte lysbildet (Figur 2C).
11. Plasser den selvklebende perfusjonsbrønndeleren tilbake på lysbildet for å danne en liten væskefylt brønn over den monterte tubule.
12. Plasser prøven på mikroskopstadiet. Plasser tilstrømnings- og utstrømningskapillærene over henholdsvis innløps- og utløpsåpningen til perfusjonsbrønnen.
    MERK: Brønndeleren kan bli stående hvis det ønskes et åpent perfusjonskammer. I dette tilfellet kan tilstrømnings- og utstrømningskapillærene justeres til motsatte sider av en bildebrønn.

Representative Results

Figur 1: Fabrikasjon av glassstenger for håndtering av malpighiske tubler.
A - E. Varmeprosess og trekking av en glassstang for å produsere en konisk og vinkel som er egnet for håndtering av MTs. Piler angir retning og størrelse på kraften som skal påføres. F. Fotografi av et passende fabrikkert glassverktøy. Skalastang = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Disseksjon av voksne Drosophila Anterior Malpighian Tubules.
A. Skjematisk representasjon av fremre MT fjerning med 2 par fine tang i kjølt Schneider medium. "A. Tubule" = Fremre MT. "P. Tubule" = bakre MT. B. Prosessen med å hente og montere ekstraherte MT-er ved hjelp av tynne glassstenger. C. Prosessen med å følge hele lengden av ekstraherte MT-er til et lysbilde for avbildning og fysiologisk vurdering. D. Representative widefield bilder av SEpH (470/510 nm ex/em) og mCherry (556/630 nm ex/em) komponenter av UAS-pHerry drevet av capaR-GAL4 som skildrer sunne fremre MTs, fremre MTs skadet av utilstrekkelig perfusjon, og misidentifiserte bakre MTs. Merk at sunne fremre MTs viser et klart utvidet blindt innledende segment, et innsnevret overgangssegment med relativt økt uttrykk for UAS-pHerry når de drives av capaR-GAL4, og et distalt hovedsegment. Skadede MT-er viser merkbare aggregater av mCherry fluorescens uten tilsvarende SEpH-fluorescens. Bakre MT-er er ensartede i diameter uten morfologisk distinkte segmenter. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Rossano et al., 2017
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Terhzaz et al., 2012
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Sozen et al., 1997
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.