द्वीप परख: ड्रोसोफिला लोकोमोटर व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट विधि

Overview

यह वीडियो द्वीप परख, एक व्यवहार विधि ड्रोसोफिला लोकोमोशन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया वर्णन करता है । नमूना प्रोटोकॉल में अर्ध-स्वचालित छवि विश्लेषण के साथ संगत परख के लिए एक सेटअप है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला द्वीप परख, जे विस एक्सप्रेस (2017) में लोकोमोटर व्यवहार का उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण, इदरहोफ एट अल(2017) का एक अंश है।

1. द्वीप परख बॉक्स का निर्माण

1. पानी की एक परत(यानी स्नान) को नियंत्रित करने के लिए एक मजबूत सामग्री से बनी ट्रे तैयार करें, जैसे पॉली मिथाइल मेथाक्रिलेट (पीएमएमए)। सुनिश्चित करें कि सामग्री सफेद नहीं है।
   नोट: 40 x 35 x 2.5 सेमी 3 के^{आयामों} की सिफारिश की जाती है(चित्रा 1ए)।
2. मक्खियों को प्रयोगशाला अंतरिक्ष में भागने से रोकने के लिए स्नान के चारों ओर रखे जाने वाले एक मजबूत, पारदर्शी सामग्री जैसे पीएमएमए से बना एक बॉक्स (42 x 38 x 25 सेमी³⁾तैयार करें। पार्श्व पक्ष पर एक छेद (20 x 30 सेमी²⁾रखें जो प्रयोगकर्ता के लिए मक्खियों के साथ आसानी से शीशियों को संभालने और उन्हें द्वीप(चित्रा 1ए)पर छोड़ने के लिए काफी बड़ा है।
3. एक ऊंचा मंच तैयार 10 x 15 x 2.5 सेमी³ आयाम में, एक अभेद्य सामग्री (पीएमएमए या प्लास्टिक) से बना है जो निर्विवाद है।
   नोट: छवि विश्लेषण के लिए अच्छा विपरीत सुनिश्चित करने के लिए इस प्लेटफ़ॉर्म पर एक समान सफेद सतह होना आवश्यक है। आकार जरूरी तय नहीं है, लेकिन यह सुनिश्चित करने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए कि सभी मक्खियां शुरू में मंच पर उतरें और उस पर चलने का मौका मिले(चित्रा 1ए)।
4. प्रयोगात्मक/फिल्मांकन सत्र के दौरान मंच के स्थितीय परिवर्तनों को रोकने के लिए या तो इसे स्नान में चिपकाकर या प्लेटफार्म बॉक्स के अंदर वजन या अन्य भारी वस्तुओं को रखकर मंच को ठीक करें ।

2. सॉफ्टवेयर आवश्यकताएं और स्थापना

1. इमेज-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर की स्थापना।
   1. द्वीप छवि श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए छवि-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर डाउनलोड करें (सामग्री की तालिकादेखें) और सॉफ्टवेयर को कंप्यूटर पर स्थापित करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित इमेजिंग-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर केवल विंडोज द्वारा समर्थित है। अन्य उपयोगकर्ताओं के लिए एक विकल्प सामग्री की तालिकामें जोड़ा गया है।

3. द्वीप परख में परीक्षण करने के लिए मक्खियों की तैयारी

1. ठंड या कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ₂₎संज्ञाहरण के तहत प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के लिए मंचन मक्खियों को इकट्ठा करें, जैसा कि पहले वर्णित है (1 - 2 दिनों की अवधि में)।
   1. प्रयोगात्मक स्थिति के अनुसार न्यूनतम 3 नमूना शीशियां तैयार करें, प्रत्येक में लगभग 15 मंचन मक्खियों होते हैं। केवल अक्षुण्ण पंखों के साथ मक्खियों का उपयोग करें और यह समान उम्र और लिंग के हैं।
      नोट: यहां वर्णित प्रयोगों के लिए, जीनोटाइप डब्ल्यू के 15 पुरुष मक्खियों वाली 5 नमूना शीशियों^- ऐक्टिन-Gal4/+ (नियंत्रण) और^{डब्ल्यू-;} Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAAi) eclosion के दिन एकत्र किए गए थे, 4 दिनों के लिए वृद्ध, और द्वीप परख प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया । आरएनएआई, नियंत्रण उपभेदों, और Actin-gal4 ड्राइवर एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया (सामग्री की मेजदेखें) ।
2. मक्खियों को ब्याज की उम्र में द्वीप परख में एकत्र मक्खियों का परीक्षण करने से पहले एनेस्थेटिक्स (सीओ 2 का उपयोग करते समय कम से कम₁दिन) से प्रभाव से बचने के लिए ठीक होने दें।

4. प्रायोगिक सेटअप

नोट: चित्रा 1बीदेखें ।

1. स्नान ट्रे में साबुन की एक छोटी राशि के साथ ठंडा पानी जोड़ें और बीच में मंच की स्थिति ।
   नोट: साबुन पानी की सतह तनाव को कम कर देता है; पानी को छूने वाली मक्खियां डूब जाएंगी। यह प्रयोगात्मक सत्र की प्रगति के दौरान बॉक्स में उड़ने वाली मक्खियों की बढ़ती मात्रा को रोकता है।
2. ट्रे के ऊपर पारदर्शी बॉक्स रखें और दीपक का उपयोग करके ऊपर से मंच को रोशन करें।
   नोट: उचित वीडियो विपरीत सुनिश्चित करने के लिए मंच की रोशनी मुख्य रूप से आवश्यक है। इसके लिए एक साधारण 12-वी एलईडी लाइट उपयुक्त है।
3. वेबकैम को सीधे प्लेटफ़ॉर्म (बॉक्स के बाहर) के ऊपर रखें और इसे कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
4. प्रयोगों से पहले विभिन्न प्रयोगात्मक डेटा को स्टोर करने के लिए कंप्यूटर पर नए फ़ोल्डर बनाएं।
   1. फ़ोल्डर बनाने के लिए चित्रा 2ए में सचित्र उदाहरण की संरचना का पालन करें। उदाहरण के लिए, यदि प्रायोगिक डिजाइन में प्रत्येक को पांच प्रतिकृति के साथ दो जीनोटाइप का परीक्षण करने की आवश्यकता है, तो पहले प्रयोग की तारीख वाले एक मुख्य फ़ोल्डर बनाएं। मुख्य फ़ोल्डर के अंदर, दो सबफोल्डर (एक प्रति जीनोटाइप) बनाएं। जीनोटाइप फ़ोल्डर्स के अंदर, पांच नए सबफोल्डर बनाएं, एक प्रति दोहराने।
      नोट: आगे के विश्लेषण के लिए, यह आवश्यक है कि व्यक्तिगत प्रयोगों के अनुरूप छवि श्रृंखला अद्वितीय नामों के साथ फ़ोल्डरों में सहेजे जाएं।

5. इंटरफ़ेस के "कैप्चर डिवाइस" अनुभाग में वीडियो सेटिंग्स सेटअप

1. इमेज-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर खोलें और "कैप्चर" टैब के तहत, "टाइम-लैप्स इमेजेज..." और उपयुक्त वेबकैम को "कैप्चर डिवाइस" के रूप में चुनें।
2. द्वीप पर एक मृत मक्खी रखें; "वीडियो सेटिंग" बॉक्स पर क्लिक करके वीडियो सेटिंग को समायोजित करें। उपकरण सलाखों के माध्यम से स्क्रॉल करें, चमक, विपरीत और रंग को इस तरह से समायोजित करें कि मृत मक्खी सफेद पृष्ठभूमि(चित्रा 2बी)पर काली दिखाई देती है। जब समायोजन पूरा हो जाता है, तो "Ok" पर क्लिक करें।

6. इंटरफ़ेस के "टाइम-लैप्स" अनुभाग में रिकॉर्डिंग और वीडियो सेविंग सेटिंग्स सेटअप

1. .avi फ़ाइल के रूप में प्रयोग को सहेजने के लिए "टाइम-लैप्स मूवी सेटअप" में सेटिंग को समायोजित करें। "ब्राउज़..." पर क्लिक करें, निर्देशिका का चयन करें जहां फिल्म संग्रहीत की जाएगी, वीडियो के नाम को परिभाषित करें, और "सहेजें" दबाएं।
   नोट: वीडियो फ़ाइल का उपयोग डेटा के परिमाणीकरण के लिए नहीं किया जाता है; हालांकि, प्रयोग के बारे में एक समग्र विचार प्राप्त करना उपयोगी हो सकता है।
2. "टाइम-लैप्स मूवी सेटअप" सेक्शन में सेटिंग्स को एडजस्ट करें।
   1. संपीड़न बॉक्स में, वीडियो संपीड़न के लिए "इंटेल IYUV कोड" का चयन करें और "हर 0.1 सेकंड में एक फ्रेम लें", "प्ले-बैक दर (प्रति सेकंड छवियां):" 10 पर चुनें।
   2. "उन्नत..." पर क्लिक करके .bmp फ्रेम के रूप में प्रयोग समय श्रृंखला सहेजें "प्रत्येक कैप्चर किए गए फ्रेम के लिए एक .bmp छवि बनाएं" चुनें। "ब्राउज़" पर क्लिक करें। "AVI फिल्म कैप्चर के दौरान" विंडो में एक ही निर्देशिका का चयन करें (जैसा कि चरण 6.1 में चुना गया है), "ओपन" पर क्लिक करें, और "ओके" दबाएं।
      नोट: ध्यान दें कि, प्रयोग के दौरान, फ़्रेम को .bmp फ़ाइलों (डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक) के रूप में संग्रहीत किया जाता है। कार्यक्रम फ्रेम को "ए" के रूप में नाम देता है जिसके बाद फ्रेम कैप्चर अनुक्रम(जैसे,"A_number.bmp")(चित्रा 2सी)के अनुरूप संख्या होती है। हमेशा एक नए फ़ोल्डर में विभिन्न प्रयोगों से संबंधित छवियों को सहेजें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पहले दर्ज की गई छवि श्रृंखला को ओवरराइट नहीं किया जाएगा। ध्यान रखें कि छवियों को स्वचालित रूप से वीडियो फ़ाइल के रूप में एक ही फ़ोल्डर में सहेजा नहीं जाता है जब तक कि इस फ़ोल्डर को "ब्राउज़..." के तहत नहीं चुना जाता है "उन्नत" बॉक्स पर क्लिक करने पर।

7. द्वीप परख और डेटा संग्रह

1. रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए इमेज-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के टाइम-लैप्स इमेज इंटरफेस में स्टार्ट बटन दबाएं।
2. यह सुनिश्चित करने के लिए मक्खियों वाली प्रयोगात्मक शीशी (चरण 3) 2-3 बार टैप करें कि मक्खियां शीशी के नीचे हैं। शीशी के प्लग को जल्दी से हटा दें और, एक जोरदार आंदोलन के साथ, मंच पर शीशी को टैप करें ताकि सभी मक्खियां एक ही समय में मंच पर गिर जाएं(चित्र 1सी)।
3. लगभग 30 एस के बाद, रिकॉर्डिंग को रोकने के लिए "स्टॉप" बटन दबाएं।
   नोट: यदि सभी मक्खियां मंच से गायब हो जाती हैं, तो रिकॉर्डिंग को पहले रोका जा सकता है।
4. छवि रिकॉर्डिंग को रोकने के बाद हाथ से मंच पर 30 एस के लिए रहने वाली मक्खियों को हटा दें।
5. अगले प्रयोग को रिकॉर्ड करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, .bmp फ़ाइलों और फिल्मों के लिए लक्ष्य निर्देशिका बदलें (धारा 6 देखें)।

Representative Results

चित्रा 1: फ्लर्चार्ट द्वीप परख की आवश्यकताओं, प्रयोगात्मक प्रक्रिया और विश्लेषण को रेखांकित करता है। (A)द्वीप परख उपकरण। (ख)द्वीप परख के लिए प्रायोगिक सेटअप । (ग)द्वीप परख । (घ)द्वीप परख डेटा की प्रसंस्करण"ड्रोसोफिला द्वीप परख" मैक्रो के साथ । "ड्रोसोफिला द्वीप परख" मैक्रो 3 उप-मैक्रो से बना है: 1) स्टैक और प्रोजेक्शन बनाएं, 2) मंच को परिभाषित करें, और 3) विश्लेषण करें। (ई)"द्वीप परख विश्लेषण" स्क्रिप्ट का उपयोग कर डेटा के प्रसंस्करण और सांख्यिकीय मूल्यांकन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2: प्रोटोकॉल के दौरान आवश्यक विभिन्न समायोजनों के उदाहरण। (क)आवश्यक निर्देशिका संरचना जिसमें द्वीप परख प्रयोगों को डेटा प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जाना चाहिए । (ख)वीडियो सेटिंग्स को एडजस्ट करते समय मक्खियों को सफेद बैकग्राउंड पर काला दिखाई देना चाहिए । (ग)इस पांडुलिपि में वर्णित इमेज-रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर द्वारा सहेजे गए इमेज फ्रेम आउटपुट फाइल्स । (घ)पीली रूपरेखा मंच चयन को दर्शाती है । "आरओआई मैनेजर" में संग्रहीत प्लेटफ़ॉर्म चयन नीले रंग में हाइलाइट किया गया है। (ई)मक्खियों को "न्यूनतम फ्लाई आकार सेटिंग" के समायोजन के दौरान सफेद डॉट्स के रूप में दर्शाया जाता है। परिणाम विंडो पिक्सल में मक्खियों के क्षेत्र को दर्शाती है। (एफ)एक एकल रिकॉर्ड की छवि फ्रेम का उदाहरण (बाईं ओर) और परिणामस्वरूप छवि ढेर में इसी फ्रेम,"ड्रोसोफिला द्वीप परख" मैक्रो (दाईं ओर) के साथ प्राप्त की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.