Островный анализ: метод высокой пропускной способности для оценки поведения дрозофилы Локомотива

Overview

Это видео описывает остров анализа, поведенческий метод, используемый для изучения Drosophila передвижения. Протокол выборки имеет настройку для анализа, совместимую с полуавтоматическим анализом изображений.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Eidhof et al.,High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Строительство острова Ассай Box

1. Подготовьте лоток из прочного материала, такого как поли метилмахкрилат (PMMA), чтобы содержатьслой воды (т.е. ванну). Убедитесь, что материал не белый.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры 40 x 35 x 2,5^{см 3} рекомендуется(рисунок 1A).
2. Подготовь коробку (42 x 38 x 25^{см 3)}из прочного прозрачного материала, такого как PMMA, для помещения вокруг ванны, чтобы предотвратить побег мух в лабораторное пространство. Поместите отверстие (20 х 30^{см 2}) на боковой стороне, которая достаточно велика для экспериментатора, чтобы легко обрабатывать флаконы с мухами и падение их на острове (Рисунок 1A).
3. Подготовь повышенную платформу размером 10 х 15 х^{2,5 см 3} в размерах, изготовленную из непроницаемого материала (PMMA или пластика), который водонепроницаем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта платформа должна иметь единую белую поверхность, чтобы обеспечить хороший контраст для анализа изображений. Размер не обязательно фиксированный, но он должен быть достаточно большим, чтобы убедиться, что все мухи изначально приземляются на платформу и получают возможность ходить поней (рисунок 1А).
4. Исправьте платформу, приклеив ее к ванне или поместив веса или другие тяжелые предметы внутри коробки платформы, чтобы предотвратить позиционные изменения платформы во время экспериментальной/съемочной сессии.

2. Требования к программному обеспечению и установка

1. Установка программного обеспечения для записи изображений.
   1. Загрузите программное обеспечение для записи изображений на острове (см. таблицу материалов)и установите программное обеспечение на компьютер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для записи изображений, описанное в этом протоколе, поддерживается только Windows. Альтернатива для других пользователей была добавлена в таблицу материалов.

3. Подготовка мух, которые будут протестированы на острове Анализа

1. Сбор постановочных мух для каждого экспериментального состояния под холодной или_{двуокиси углерода}(CO 2) анестезии, как описано ранее (в течение 1 - 2 дней).
   1. Подготовь как минимум 3 пробных флакона на экспериментальное состояние, каждый из которых содержит около 15 постановочных мух. Используйте только мух с нетронутыми крыльями и которые имеют аналогичный возраст и пол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, описанных здесь, 5 образцов флаконов, содержащих 15 самцов мух генотипов w^-; Actin-Gal4 / (контроль) и w^-; Actin-Gal4/GD11950 (тефу РНК) были собраны в день выкупа, в возрасте 4 дней, и были использованы для выполнения анализа острова. РНК, контрольные штаммы и водитель Actin-gal4 были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов).
2. Пусть мухи восстановить, чтобы избежать последствий от анестезии (по крайней мере 1_{день при использовании}CO 2 ) до тестирования собранных мух на острове анализа в возрасте от интереса.

4. Экспериментальная установка

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 1B.

1. Добавить холодную воду с небольшим количеством мыла в лоток для ванны и положение платформы в середине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыло уменьшает поверхностное натяжение воды; мухи, которые касаются воды утонет. Это предотвращает увеличение количества мух, летящих в коробке во время прогрессирования экспериментальной сессии.
2. Поместите прозрачную коробку поверх лотка и осветите платформу сверху с помощью лампы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Освещение платформы в основном требуется для обеспечения надлежащего контраста видео. Для этого подходит обычный 12-V светодиодный свет.
3. Распоитив веб-камеру прямо над платформой (вне коробки) и подключите ее к компьютеру.
4. Создавайте новые папки на компьютере для хранения различных экспериментальных данных до начала экспериментов.
   1. Следуйте структуре примера, иллюстрированного на рисунке 2А, чтобы создать папки. Например, если экспериментальный проект требует тестирования двух генотипов по пять репликаций каждый, сначала создайте основную папку, содержащую дату эксперимента. Внутри основной папки создайте два субфолдера (по одному на генотип). Внутри папок генотипа создайте пять новых субфолдеров, по одному на репликацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшего анализа важно, чтобы серия изображений, соответствующая отдельным экспериментам, сохранена в папках с уникальными именами.

5. Настройка настроек видео в разделе "Захват устройства" интерфейса

1. Откройте программное обеспечение для записи изображений и под вкладкой "Захват" нажмите на кнопку "Time-Lapse Images..." и выберите соответствующую веб-камеру в качестве "Устройства захвата".
2. Поместите мертвую муху на остров; настроить настройки видео, нажав на поле "Настройки видео". Прокрутите бары инструментов, регулируя яркость, контрастность и цвет таким образом, чтобы мертвая муха появилась черной на белом фоне(рисунок 2B). Когда корректировки будут завершены, нажмите кнопку "Хорошо".

6. Настройка настроек для записи и экономии видео в разделе интерфейса "Time-lapse"

1. Отрегулируйте настройки в "Time-Lapse Movie Setup", чтобы сохранить эксперимент в качестве .avi файла. Нажмите на кнопку "Просмотреть...", выберите каталог, где будет храниться фильм, определите название видео и нажмите кнопку "сохранить".
   ПРИМЕЧАНИЕ: Видео файл не используется для количественной оценки данных; однако, возможно, было бы полезно получить общее представление об эксперименте.
2. Отрегулируйте настройки в разделе "Настройка фильма Time-Lapse".
   1. В поле сжатия выберите "Код Intel IYUV" для сжатия видео и выберите "Возьмите один кадр каждые 0,1 секунды", с "Play-back скорость (изображения в секунду):" на 10.
   2. Сохранить серию времени эксперимента, .bmp кадры, нажав на "Advanced ..." Выберите "Создайте .bmp изображение для каждого захваченного кадра". Нажмите на кнопку "Просмотреть". Выберите тот же каталог в окне "Во время захвата фильма AVI" (выбранный в шаге 6.1), нажмите кнопку "Открыть" и нажмите "Ok".
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что в ходе эксперимента кадры хранятся в качестве .bmp файлов (необходимых для анализа данных). Программа называет кадры "А", за которым следует число,соответствующее последовательности захвата кадра (например, "A_number.bmp")(рисунок 2C). Всегда сохраните изображения, относящиеся к различным экспериментам, в новой папке, чтобы гарантировать, что ранее записанные серии изображений не будут перезаписаны. Имейте в виду, что изображения не сохраняются автоматически в той же папке, что и видео файл, если эта папка не выбрана под "Просмотреть ..." при нажатии на поле "Advanced".

7. Островная анализ и сбор данных

1. Нажмите кнопку «Пуск» в интерфейсе замедленного изображения программного обеспечения для записи изображений, чтобы начать запись.
2. Нажмите экспериментальный флакон, содержащий мух (шаг 3) 2-3 раза, чтобы убедиться, что мухи находятся в нижней части флакона. Быстро удалите штепсельную вилку флакона и, энергичным движением, коснитесь флакона на платформе так, чтобы все мухи упали на платформу в то же время(рисунок 1C).
3. Примерно через 30 с, нажмите кнопку "Стоп", чтобы остановить запись.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если все мухи исчезнут с платформы, запись может быть остановлена раньше.
4. Удалите мух, которые остаются в течение 30 с на платформе вручную после остановки записи изображения.
5. Прежде чем приступить к записи следующего эксперимента, измените целевой каталог для .bmp файлов и фильмов (см. раздел 6).

Representative Results

Рисунок 1: Flowchart с изложением требований, экспериментальной процедуры и анализа острова анализа. (A)Остров анализа оборудования. (B)Экспериментальная установка для анализа острова. (C) Остров анализа. (D)Обработка данных островного анализа смакросом "Остров Дрозофила". Макро"Drosophila Island Assay" состоит из 3 суб макросов: 1) сделать стек и проекцию, 2) определить платформу и 3) анализ. (E)Обработка и статистическая оценка данных с использованием сценария "Анализ анализа острова". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Примеры различных корректировок, необходимых во время протокола. (A)Необходимая структура каталога, в которой островные эксперименты по анализу должны храниться для обработки и анализа данных. (B)При настройке настроек видео мухи должны отображаться черными на белом фоне. (C)Файлы вывода кадра изображения, сохраненные программным обеспечением для записи изображений, описанным в этой рукописи. (D)желтый контур показывает выбор платформы. Сохраненный выбор платформы в "ROI Manager" выделен синим цветом. (E)Мухи представлены как белые точки во время корректировки "Минимальный размер мухи настройки". Окно результатов показывает область мух в пикселях. (F)Пример одного записанного кадра изображения (слева) и соответствующего кадра в полученном стеке изображений, полученного с помощью макроса"Drosophila Island Assay" (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.