Ada Testi: Drosophila Locomotor Davranışını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Yöntem

Overview

Bu video, Drosophila locomotion'ı incelemek için kullanılan bir davranış yöntemi olan ada testini açıklar. Örnek protokol, yarı otomatik görüntü analizi ile uyumlu test için bir kurulum içerir.

Protocol

Bu protokol, Drosophila Adası Tahlilinde Locomotor Davranışının Yüksek Verimli Analizi, J. Vis. Exp. (2017) Eidhof ve ark.'danbir alıntıdır.

1. Ada Tahlil Kutusunun İnşası

1. Bir su tabakası(yani banyo) içerecek şekilde poli metil methakrilat (PMMA) gibi sağlam bir malzemeden yapılmış bir tepsi hazırlayın. Malzemenin beyaz olmadığından emin olun.
   NOT: 40 x 35 x 2,5 cm³ boyutları önerilir (Şekil 1A).
2. Sineklerin laboratuvar alanına kaçmasını önlemek için banyonun etrafına yerleştirilecek PMMA gibi sağlam, şeffaf bir malzemeden yapılmış bir kutu (42 x 38 x 25 cm³⁾hazırlayın. Yanal tarafa, deneycinin şişeleri sineklerle kolayca idare etmesi ve adaya bırakması için yeterince büyük bir delik⁽²⁰x 30 cm 2) yerleştirin (Şekil 1A).
3. Su geçirmez geçirimsiz bir malzemeden (PMMA veya plastik) yapılmış, boyut olarak 10 x 15 x^2,5 cm 3 yükseltilmiş bir platform hazırlayın.
   NOT: Bu platform, görüntü analizi için iyi kontrast sağlamak için düzgün bir beyaz yüzeye sahip olmak zorundadır. Boyut mutlaka sabit değildir, ancak tüm sineklerin başlangıçta platforma indiğinden ve üzerinde yürüme şansı elde ettiğinden emin olacak kadar büyük olmalıdır (Şekil 1A).
4. Platformu banyoya yapıştırarak veya deneysel/film çekimi sırasında platformun konumsal değişikliklerini önlemek için platform kutusunun içine ağırlıklar veya diğer ağır nesneler yerleştirerek sabitleyin.

2. Yazılım Gereksinimleri ve Kurulumu

1. Görüntü kayıt yazılımının kurulumu.
   1. Ada görüntü serisini kaydetmek için görüntü kayıt yazılımını indirin (Malzeme Tablosunabakın) ve yazılımı bir bilgisayara yükleyin.
      NOT: Bu iletişim kuralında açıklanan görüntüleme kayıt yazılımı yalnızca Windows tarafından desteklenir. Malzeme Tablosu'na diğer kullanıcılar için bir alternatif eklenmiştir.

3. Adada Test Edilecek Sineklerin Hazırlanması Tahlil

1. Daha önce açıklandığı gibi (1 - 2 günlük bir süre boyunca) soğuk veya karbondioksit (CO₂₎anestezisi altında her deneysel durum için aşamalı sinekleri toplayın.
   1. Deneysel durum başına her biri yaklaşık 15 aşamalı sinek içeren en az 3 örnek şişe hazırlayın. Sadece sağlam kanatlı ve benzer yaş ve cinsiyete sahip sinekleri kullanın.
      NOT: Burada açıklanan deneyler için, genotiplerin 15 erkek sinekini içeren 5 örnek şişe^-; Actin-Gal4/+ (kontrol) ve w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) eklosyon gününde toplanmış, 4 gün yaşlanmış ve ada tahlilini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. RNAi, kontrol suşları ve Actin-gal4 sürücüsü ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Toplanan sinekleri ilgi çağında test etmeden önce anesteziklerden (CO₂kullanırken en az 1 gün) etkilenmemek için sineklerin iyileşmesine izin verin.

4. Deneysel Kurulum

NOT: Bkz. Şekil 1B.

1. Banyo tepsisine az miktarda sabunla soğuk su ekleyin ve platformu ortaya yerleştirin.
   NOT: Sabun suyun yüzey gerilimini azaltır; suya dokunan sinekler boğulur. Bu, deneysel oturumun ilerlemesi sırasında kutuda uçan sineklerin artmasını önler.
2. Şeffaf kutuyu tepsinin üzerine yerleştirin ve platformu bir lamba kullanarak yukarıdan aydınlatın.
   NOT: Platformun aydınlatılması esas olarak uygun video kontrastını sağlamak için gereklidir. Bunun için sıradan bir 12-V LED ışık uygundur.
3. Web kamerasını doğrudan platformun üzerine (kutunun dışına) yerleştirin ve bir bilgisayara bağlayın.
4. Denemelerden önce farklı deneysel verileri depolamak için bilgisayarda yeni klasörler oluşturun.
   1. Klasörleri oluşturmak için Şekil 2A'da gösterilen örneğin yapısını izleyin. Örneğin, deneysel tasarım her biri beş çoğaltmalı iki genotip test etmeyi gerektiriyorsa, önce deneme tarihini içeren bir ana klasör oluşturun. Ana klasörün içinde iki alt klasör oluşturun (genotip başına bir tane). Genotip klasörlerinin içinde, çoğaltma başına bir tane olmak üzere beş yeni alt klasör oluşturun.
      NOT: Daha fazla analiz için, tek tek denemelere karşılık gelen görüntü serisinin benzersiz adlara sahip klasörlere kaydedilmesi önemlidir.

5. Arayüzün "Yakalama Cihazı" Bölümünde Video Ayarları Kurulumu

1. Görüntü kayıt yazılımını açın ve "Yakala" sekmesinin altında "Zaman Atlamalı Görüntüler..." ve "Yakalama Cihazı" olarak uygun web kamerasını seçin.
2. Adaya ölü bir sinek yerleştirin; "Video Ayarları" kutusuna tıklayarak video ayarlarını yapın. Araç çubukları arasında ilerleyin, parlaklığı, kontrastı ve rengi ölü sinek beyaz bir arka plan üzerinde siyah görünecek şekilde ayarlayın(Şekil 2B). Ayarlamalar tamamlandığında "Tamam"ı tıklatın.

6. Arayüzün "Zaman Atlamalı" Bölümünde Kayıt ve Video Kaydetme Ayarları Kurulumu

1. Denemeyi .avi dosyası olarak kaydetmek için "Zaman Atlamalı Film Kurulumu"ndaki ayarları yapın. "Gözat..." seçeneğine tıklayın, filmin depolanacağı dizini seçin, videonun adını tanımlayın ve "kaydet" tuşuna basın.
   NOT: Video dosyası verilerin ölçülmesi için kullanılmaz; ancak, deney hakkında genel bir fikir almak yararlı olabilir.
2. "Zaman Atlamalı Film Kurulumu" bölümündeki ayarları yapın.
   1. Sıkıştırma kutusunda, video sıkıştırma için "Intel IYUV kodu"nu seçin ve "Oynatma hızı (saniyedeki görüntüler):" ile 10'da "Her 0,1 saniyede bir kare al"ı seçin.
   2. "Gelişmiş..." üzerine tıklayarak deneme süresi serisini .bmp kareler olarak kaydedin. "Yakalanan her kare için .bmp görüntü oluştur"u seçin. "Gözat" ı tıklayın. "AVI film çekimi sırasında" penceresinde aynı dizini seçin (adım 6.1'de seçildiği gibi), "Aç" ı tıklayın ve "Tamam" tuşuna basın.
      NOT: Deneme sırasında çerçevelerin .bmp dosyaları olarak depolandığına dikkat edin (veri analizi için gereklidir). Program çerçeveleri "A" olarak adlandırır ve ardından kare yakalama sırasına karşılık gelen sayıyı(örneğin,"A_number.bmp") (Şekil 2C). Önceden kaydedilmiş görüntü serilerinin üzerine yazılmayacağından emin olmak için her zaman farklı denemelere ait görüntüleri yeni bir klasöre kaydedin. Bu klasör "Gözat..." altında seçilmediği sürece görüntülerin video dosyasıyla otomatik olarak aynı klasöre kaydedilmediğini unutmayın. "Gelişmiş" kutusunu tıklattıktan sonra.

7. Ada Tahlil ve Veri Toplama

1. Kaydı başlatmak için görüntü kayıt yazılımının zaman atlamalı görüntü arabirimindeki başlat düğmesine basın.
2. Sineklerin şişenin dibinde olduğundan emin olmak için sinek içeren deneysel şişeye (adım 3) 2-3 kez dokunun. Şişenin fişini hızlı bir şekilde çıkarın ve güçlü bir hareketle platformdaki şişeye dokunun, böylece tüm sinekler aynı anda platforma düşer(Şekil 1C).
3. Yaklaşık 30 sn'den sonra, kaydı durdurmak için "Durdur" düğmesine basın.
   NOT: Tüm sinekler platformdan kaybolursa, kayıt daha önce durdurulabilir.
4. Görüntü kaydını durdurduktan sonra platformda 30 sn kalan sinekleri elle çıkarın.
5. Bir sonraki denemeyi kaydetmeye geçmeden önce, .bmp dosyalarının ve filmlerin hedef dizinini değiştirin (bkz. bölüm 6).

Representative Results

Şekil 1: Ada testinin gerekliliklerini, deneysel prosedürünü ve analizini özetleyen akış çizelgesi. (A) Ada tahlil ekipmanları. (B) Ada tahlil için deneysel kurulum. (C) Ada tahlil. (D) Ada tahlil verilerinin"Drosophila Adası Tahlil" makrosu ile işlenmesi. "Drosophila Island Assay" makrosu 3 alt makrodan oluşur: 1) yığın ve projeksiyon yapmak, 2) platform tanımlamak ve 3) analiz. (E) "Ada Tahlil Analizi" betiği kullanılarak verilerin işlenmesi ve istatistiksel olarak değerlendirilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protokol sırasında gerekli olan farklı ayarlama örnekleri. (A) Veri işleme ve analiz için ada tahlil deneylerinin depolandığı gerekli dizin yapısı. (B) Video ayarlarını yaparken, sinekler beyaz bir arka plan üzerinde siyah görünmelidir. (C) Bu yazıda açıklanan görüntü kayıt yazılımı tarafından kaydedilen görüntü çerçevesi çıktı dosyaları. (D) Sarı anahat platform seçimini gösterir. "Yatırım Getirisi Yöneticisi"ndeki depolanan platform seçimi mavi renkle vurgulanır. (E) Sinekler, "Minimum sinek boyutu ayarı" ayarlaması sırasında beyaz noktalar olarak temsil edilir. Sonuçlar penceresi sineklerin alanını piksel cinsinden gösterir. (F)"Drosophila Island Assay" makrosu (sağda) ile elde edilen tek bir kaydedilmiş görüntü çerçevesi (solda) ve elde edilen görüntü yığınındaki karşılık gelen çerçeve örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.