Island Assay: En high-throughput metode til at evaluere Drosophila Locomotor Behavior

Overview

Denne video beskriver øen assay, en adfærdsmæssig metode, der anvendes til at studere Drosophila bevægelse. Eksempelprotokollen indeholder en opsætning til analysen, der er kompatibel med halvautomatisk billedanalyse.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Eidhof et al.,High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Opførelse af øen Assay Box

1. Forbered en bakke lavet af et robust materiale, såsom poly methyl methacrylat (PMMA), til at indeholde et lag vand(dvs. et bad). Sørg for, at materialet ikke er hvidt.
   BEMÆRK: Dimensioner på 40 x 35 x 2,5 cm³ anbefales(Figur 1A).
2. Forbered en kasse (42 x 38 x 25 cm³) lavet af et robust, gennemsigtigt materiale, såsom PMMA, der skal placeres omkring badet for at forhindre fluerne i at slippe ud i laboratorierummet. Placer et hul (20 x 30 cm²⁾på sidesiden, der er stort nok til, at eksperimentatoren nemt kan håndtere hætteglassene med fluer og slippe dem på øen (Figur 1A).
3. Forbered en forhøjet platform 10 x 15 x 2,5 cm³ i dimension, lavet af et uigennemtrængeligt materiale (PMMA eller plast), der er vandtæt.
   BEMÆRK: Denne platform er forpligtet til at have en ensartet hvid overflade for at sikre god kontrast til billedanalyse. Størrelsen er ikke nødvendigvis fast, men den skal være stor nok til at sikre, at alle fluer i første omgang lander på platformen og får chancen for at gå på den(figur 1A).
4. Fastgør platformen ved enten at lime den ind i badet eller placere vægte eller andre tunge genstande inde i platformboksen for at forhindre positionsændringer af platformen under forsøgs-/filmsessionen.

2. Softwarekrav og -installation

1. Installation af billedoptagelsessoftware.
   1. Download billedoptagelsessoftware for at optage øens billedserie (se materialeoversigten) og installere softwaren på en computer.
      BEMÆRK: Den billedoptagelsessoftware, der er beskrevet i denne protokol, understøttes kun af Windows. Der er føjet et alternativ til andre brugere i materialeoversigten.

3. Forberedelse af fluer, der skal testes i øen Assay

1. Indsamle iscenesatte fluer for hver eksperimentel tilstand under kulde eller kuldioxid (CO₂) anæstesi, som tidligere beskrevet (over en periode på 1 - 2 dage).
   1. Der fremstilles mindst 3 prøveglas pr. forsøgstilstand, der hver indeholder ca. 15 iscenesatte fluer. Brug kun fluer med intakte vinger, og som er af samme alder og køn.
      BEMÆRK: Til de her beskrevne forsøg er der 5 prøveglas med 15 hanfluer af genotyperne m^-; Actin-Gal4/+ (kontrol) og w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) blev indsamlet på dagen for eclosion, i alderen i 4 dage, og blev brugt til at udføre øen assay. RNAi, kontrolstammer, og Actin-gal4 føreren blev opnået fra en kommerciel kilde (se tabellen over materialer).
2. Lad fluerne komme sig for at undgå virkninger fra bedøvelsesmidlerne (mindst 1 dag, når du bruger CO_2),før du tester de indsamlede fluer i øens analyse i en alder af interesse.

4. Eksperimentel opsætning

BEMÆRK: Se figur 1B.

1. Tilsæt koldt vand med en lille mængde sæbe til badebakken og placer platformen i midten.
   BEMÆRK: Sæben reducerer vandets overfladespænding; fluer, der rører vandet, vil drukne. Dette forhindrer stigende mængder fluer, der flyver i kassen under progressionen af den eksperimentelle session.
2. Placer den gennemsigtige boks oven på bakken, og belys platformen ovenfra ved hjælp af en lampe.
   BEMÆRK: Belysning af platformen er hovedsageligt nødvendig for at sikre korrekt videokontrast. En almindelig 12-V LED-lys er passende til dette.
3. Placer webkameraet direkte over platformen (uden for boksen), og tilslut det til en computer.
4. Opret nye mapper på computeren for at gemme de forskellige eksperimentelle data forud for eksperimenterne.
   1. Følg strukturen i det eksempel, der er illustreret i figur 2A, for at oprette mapperne. Hvis forsøgsdesignet f.eks. kræver test af to genotyper med fem replikater hver, skal du først oprette en hovedmappe, der indeholder datoen for eksperimentet. Opret to undermapper (en pr. genotype) i hovedmappen. Opret fem nye undermapper, én pr. repliker i genotypemapperne.
      BEMÆRK: For yderligere analyse er det vigtigt, at billedserien, der svarer til individuelle eksperimenter, gemmes i mapper med entydige navne.

5. Installation af videoindstillinger i afsnittet "Hent enhed" i grænsefladen

1. Åbn billedoptagelsessoftwaren, og klik på "Time-Lapse Images..." under fanen "Hent". og vælg det relevante webcam som "Capture Device".
2. Placer en død flue på øen; justere videoindstillingerne ved at klikke på feltet "Videoindstillinger". Rul gennem værktøjspanelerne, juster lysstyrke, kontrast og farve på en sådan måde, at den døde flue vises sort på en hvid baggrund (Figur 2B). Klik på "OK", når justeringerne er fuldført.

6. Installation af indstillinger for optagelse og lagring af video i afsnittet "Tidsforskydning" i grænsefladen

1. Juster indstillingerne i "Time-Lapse Movie Setup" for at gemme eksperimentet som en .avi fil. Klik på "Gennemse...", vælg den mappe, hvor filmen skal gemmes, definer navnet på videoen, og tryk på "gem".
   BEMÆRK: Videofilen bruges ikke til kvantificering af data. Det kan dog være nyttigt at få en overordnet idé om eksperimentet.
2. Juster indstillingerne i afsnittet "Time-Lapse Movie Setup".
   1. I komprimeringsboksen skal du vælge "Intel IYUV-kode" til videokomprimering og vælge "Tag et billede hvert 0,1 sekund", med "Afspilningshastigheden (billeder pr. sekund):" ved 10.
   2. Gem eksperimenttidsserien som .bmp rammer ved at klikke på "Avanceret..." Vælg "Opret et .bmp billede for hver optagen ramme". Klik på "Gennemse". Vælg den samme mappe i vinduet "Under optagelse af AVI-film" (som valgt i trin 6.1), klik på "Åbn", og tryk på "Ok".
      BEMÆRK: Bemærk, at rammerne under eksperimentet gemmes som .bmp filer (kræves til dataanalyse). Programmet navngiver rammerne som "A" efterfulgt af det tal, der svarer til rammefangstsekvensen (f.eks."A_number.bmp") (Figur 2C). Gem altid de billeder, der tilhører forskellige eksperimenter, i en ny mappe for at sikre, at tidligere optagede billedserier ikke overskrives. Vær opmærksom på, at billederne ikke automatisk gemmes i samme mappe som videofilen, medmindre denne mappe er valgt under "Gennemse..." ved at klikke på boksen "Avanceret".

7. Island Assay og dataindsamling

1. Tryk på startknappen i time-lapse-billedgrænsefladen i billedoptagelsessoftwaren for at starte optagelsen.
2. Tryk på det eksperimentelle hætteglas, der indeholder fluer (trin 3) 2-3 gange for at sikre, at fluer er i bunden af hætteglasset. Fjern hurtigt stikket på hætteglasset, og tryk med en kraftig bevægelse på hætteglasset på platformen, så alle fluer falder på platformen på samme tid (Figur 1C).
3. Efter ca. 30 s skal du trykke på knappen "Stop" for at stoppe optagelsen.
   BEMÆRK: Hvis alle fluer forsvinder fra platformen, kan optagelsen stoppes tidligere.
4. Fjern fluerne, der forbliver i 30 s på platformen i hånden efter at have stoppet billedoptagelsen.
5. Før du fortsætter med at optage det næste eksperiment, skal du ændre destinationsmappen for .bmp filer og film (se afsnit 6).

Representative Results

Figur 1: Rutediagram, der skitserer behovene, forsøgsproceduren og analysen af øens analyse. (A)Island assay udstyr. (B) Eksperimentel opsætning for øens analyse. (C)Island assay. (D) Behandling af ø-analysedata med makroen"Drosophila Island Assay". Makroen"Drosophila Island Assay" består af 3 undermakroer: 1) lav stak og projektion, 2) definer platform og 3) analyse. (E) Behandling og statistisk evaluering af data ved hjælp af scriptet "Island Assay Analysis". Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Eksempler på forskellige justeringer, der kræves i protokollen. (A)Den krævede mappestruktur, hvor øanalyseforsøg skal lagres til databehandling og -analyse. (B) Når videoindstillingerne justeres, skal fluerne vises sort på en hvid baggrund. (C) Billedrammeoutputfiler som gemt af den billedoptagelsessoftware, der er beskrevet i dette manuskript. (D) Den gule kontur viser valg af platform. Det gemte platformvalg i "ROI Manager" er fremhævet med blåt. (E) Fluer er repræsenteret som hvide prikker under justeringen af indstillingen "Mindste flyvestørrelse.". Resultatvinduet viser fluernes område i pixel. (F) Eksempel på en enkelt indspillet billedramme (til venstre) og den tilsvarende ramme i den resulterende billedstak, opnået med makroen "Drosophila Island Assay" (til højre). Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.