Saggio dell'isola: un metodo ad alta produttività per valutare il comportamento locomotore della Drosophila

Overview

Questo video descrive il saggio dell'isola, un metodo comportamentale utilizzato per studiare la locomozione di Drosophila. Il protocollo di esempio presenta una configurazione per il test compatibile con l'analisi semi-automatizzata delle immagini.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Eidhof et al.,High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp.

1. Costruzione della scatola di saggi dell'isola

1. Preparare un vassoio fatto di un materiale robusto, come il metacrilato di polimetile (PMMA), per contenere uno stratod'acqua (cioè un bagno). Assicurarsi che il materiale non sia bianco.
   NOTA: Si raccomandano dimensioni di 40 x 35 x 2,5 cm³ (Figura 1A).
2. Preparare una scatola (42 x 38 x 25 cm³⁾realizzata in un materiale robusto e trasparente, come il PMMA, da posizionare intorno al bagno per evitare che le mosche fuoriesano nello spazio di laboratorio. Posizionare un foro (20 x 30 cm²) sul lato laterale abbastanza grande da far maneggiare facilmente le fiale con mosche e lasciarle cadere sull'isola(Figura 1A).
3. Preparare una piattaforma sopraelevata di dimensioni 10 x 15 x 2,5 cm^3, realizzata in un materiale impermeabile (PMMA o plastica) a tenuta stagna.
   NOTA: Questa piattaforma deve avere una superficie bianca uniforme per garantire un buon contrasto per l'analisi delle immagini. La dimensione non è necessariamente fissa, ma dovrebbe essere abbastanza grande da assicurarsi che tutte le mosche atterrino inizialmente sulla piattaforma e hanno la possibilità di camminare su di essa (Figura 1A).
4. Fissare la piattaforma incollandolo al bagno o posizionando pesi o altri oggetti pesanti all'interno della scatola della piattaforma per evitare cambiamenti posizionali della piattaforma durante la sessione sperimentale / di riprese.

2. Requisiti software e installazione

1. Installazione di software di registrazione delle immagini.
   1. Scaricare il software di registrazione delle immagini per registrare la serie di immagini dell'isola (vedere la tabella dei materiali) e installare il software su un computer.
      NOTA: Il software di registrazione dell'imaging descritto in questo protocollo è supportato solo da Windows. Un'alternativa per altri utenti è stata aggiunta alla tabella dei materiali.

3. Preparazione delle mosche da testare nel saggio dell'isola

1. Raccogliere mosche messe in scena per ogni condizione sperimentale in anestesia fredda o_{di anidride carbonica}(CO 2), come descritto in precedenza (per un periodo di 1 - 2 giorni).
   1. Preparare un minimo di 3 fiale campione per condizione sperimentale, ognuna contenente circa 15 mosche a fasi. Usa solo mosche con ali intatte e che hanno età e sesso simili.
      NOTA: Per gli esperimenti qui descritti, 5 fiale campione contenenti 15 mosche maschili dei genotipi w^-; Actin-Gal4/+ (controllo) e w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) sono stati raccolti il giorno dell'eclosion, invecchiati per 4 giorni, e sono stati utilizzati per eseguire il test dell'isola. RNAi, ceppi di controllo e il conducente Actin-gal4 sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi tabella dei materiali).
2. Lascia che le mosche si riprendano per evitare effetti dagli anestetici (almeno 1 giorno quando si utilizza CO₂) prima di testare le mosche raccolte nel saggio dell'isola all'età di interesse.

4. Configurazione sperimentale

NOTA: Cfr. figura 1B.

1. Aggiungere acqua fredda con una piccola quantità di sapone sul vassoio del bagno e posizionare la piattaforma al centro.
   NOTA: Il sapone diminuisce la tensione superficiale dell'acqua; mosche che toccano l'acqua annegheranno. Ciò impedisce l'aumento delle quantità di mosche che volano nella scatola durante la progressione della sessione sperimentale.
2. Posizionare la scatola trasparente sopra il vassoio e illuminare la piattaforma dall'alto utilizzando una lampada.
   NOTA: L'illuminazione della piattaforma è necessaria principalmente per garantire un corretto contrasto video. Una normale luce LED a 12 V è appropriata per questo.
3. Posizionare la webcam direttamente sopra la piattaforma (fuori dagli schemi) e collegarla a un computer.
4. Creare nuove cartelle nel computer per archiviare i diversi dati sperimentali prima degli esperimenti.
   1. Seguire la struttura dell'esempio illustrato nella figura 2A per creare le cartelle. Ad esempio, se la progettazione sperimentale richiede il test di due genotipi con cinque repliche ciascuna, creare innanzitutto una cartella principale contenente la data dell'esperimento. All'interno della cartella principale, creare due sottocartelle (una per genotipo). All'interno delle cartelle del genotipo, creare cinque nuove sottocartelle, una per replica.
      NOTA: Per ulteriori analisi, è essenziale che le serie di immagini corrispondenti ai singoli esperimenti siano salvate in cartelle con nomi univoci.

5. Configurazione delle impostazioni video nella sezione "Dispositivo di acquisizione" dell'interfaccia

1. Aprire il software di registrazione delle immagini e, nella scheda "Acquisizione", fare clic su "Immagini time-lapse..." e selezionare la webcam appropriata come "Dispositivo di acquisizione".
2. Metti una mosca morta sull'isola; regolare le impostazioni video cliccando sulla casella "Impostazioni video". Scorrere le barre degli strumenti, regolando luminosità, contrasto e colore in modo che la mosca morta appaia nera su uno sfondo bianco (Figura 2B). Al termine delle regolazioni, fare clic su "OK".

6. Configurazione delle impostazioni di registrazione e salvataggio video nella sezione "Time-lapse" dell'interfaccia

1. Regolate le impostazioni in "Time-Lapse Movie Setup" per salvare l'esperimento come file .avi file. Fare clic su "Sfoglia...", selezionare la directory in cui verrà archiviato il filmato, definire il nome del video e premere "salva".
   NOTA: Il file video non viene utilizzato per la quantificazione dei dati; tuttavia, potrebbe essere utile avere un'idea generale dell'esperimento.
2. Regolare le impostazioni nella sezione "Time-Lapse Movie Setup".
   1. Nella casella di compressione, selezionare "Codice Intel IYUV" per la compressione video e scegliere "Prendi un fotogramma ogni 0,1 secondi", con la "Velocità di riproduzione (immagini al secondo):" a 10.
   2. Salvare le serie temporali dell'esperimento .bmp fotogrammi facendo clic su "Avanzate..." Selezionare "Crea un'.bmp per ogni fotogramma acquisito". Clicca su "Sfoglia". Selezionare la stessa directory nella finestra "Durante l'acquisizione del filmato AVI" (scelta nel passaggio 6.1), fare clic su "Apri" e premere "OK".
      NOTA: Si noti che, durante l'esperimento, i frame vengono memorizzati come file .bmp (necessari per l'analisi dei dati). Il programma nomina i fotogrammi come "A"seguitidal numero corrispondente alla sequenza di acquisizione del fotogramma ( ad esempio , "A_number.bmp") (Figura 2C). Salvare sempre le immagini appartenenti a diversi esperimenti in una nuova cartella per assicurarsi che le serie di immagini registrate in precedenza non vengano sovrascritte. Tenere presente che le immagini non vengono salvate automaticamente nella stessa cartella del file video a meno che questa cartella non sia selezionata in "Sfoglia..." facendo clic sulla casella "Avanzate".

7. Saggio dell'isola e raccolta dei dati

1. Premere il pulsante start nell'interfaccia dell'immagine time-lapse del software di registrazione delle immagini per avviare la registrazione.
2. Toccare il flaconcino sperimentale contenente mosche (fase 3) 2-3 volte per assicurarsi che le mosche si trovano nella parte inferiore del flaconcino. Rimuovere rapidamente la spina del flaconcino e, con un movimento vigoroso, toccare il flaconcino sulla piattaforma in modo che tutte le mosche cadano sulla piattaforma contemporaneamente (Figura 1C).
3. Dopo circa 30 s, premere il pulsante "Stop" per interrompere la registrazione.
   NOTA: Se tutte le mosche scompaiono dalla piattaforma, la registrazione può essere interrotta prima.
4. Rimuovere manualmente le mosche che rimangono per 30 s sulla piattaforma dopo aver interrotto la registrazione dell'immagine.
5. Prima di procedere alla registrazione dell'esperimento successivo, modificare la directory di destinazione per .bmp file e filmati (vedere la sezione 6).

Representative Results

Figura 1: Diagramma di flusso che delinea i requisiti, la procedura sperimentale e l'analisi del saggio dell'isola. (A) Apparecchiature per il dosaggio dell'isola. (B) Installazione sperimentale per il saggio dell'isola. (C) Saggio dell'isola. (D) Elaborazione dei dati di dosaggio dell'isola con la macro"Drosophila Island Assay". La macro "Drosophila Island Assay" è composta da 3 sotto-macro: 1) fare stack e proiezione, 2) definire la piattaforma e 3) analisi. (E) Elaborazione e valutazione statistica dei dati mediante lo script "Island Assay Analysis". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di diverse regolazioni richieste durante il protocollo. (A) La struttura di directory richiesta in cui devono essere archiviati gli esperimenti di dosaggio delle isole per l'elaborazione e l'analisi dei dati. (B) Quando si regolano le impostazioni video, le mosche devono apparire nere su uno sfondo bianco. (C) File di output dei fotogrammi immagine salvati dal software di registrazione delle immagini descritto in questo manoscritto. (D) Il contorno giallo mostra la selezione della piattaforma. La selezione della piattaforma memorizzata in "ROI Manager" è evidenziata in blu. (E) Le mosche sono rappresentate come punti bianchi durante la regolazione dell'impostazione "Dimensione minima della mosca". La finestra dei risultati mostra l'area delle mosche in pixel. (F) Esempio di una singola cornice di immagine registrata (a sinistra) e della cornice corrispondente nella pila di immagini risultante, ottenuta con la macro "Drosophila Island Assay" (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.