اثنين من فوتون الليزر الناجم عن الإصابة العصبية: طريقة لمراقبة انحطاط أكسون والتجديد في يرقات Drosophila

Overview

يصف هذا الفيديو استئصال الليزر من فوتونين اثنين من المحاور في يرقة Drosophila melanogaster وبروتوكول مثال للحث على الإصابة وتصوير موقع الإصابة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Li et al.,نموذج إصابة Drosophila In Vivo لدراسة التجديد العصبي في الجهاز العصبي المحيطي والمركزي، J. Vis. Exp. (2018).

1. اثنين من فوتون الاصابة والتصوير Confocal

1. إعداد المجهر
   ملاحظة: تم استخدام مجهر مسح ليزر confocal مع ليزر فوتونين اثنين لهذه التجربة ، ولكن الأنظمة الأخرى ذات الإعداد المكافئ ستكون كافية أيضا. تم استخدام ليزر الفوتونين (930 نانومتر) لتقديم الإصابة واستخدم ليزر الأرجون (488 نانومتر) للتصوير البؤري ل GFP.
   1. في بداية كل جلسة، قم بتشغيل الليزر ثنائي الفوتون و/أو الليزر (الليزر) البؤري والمجهر. افتح برنامج التصوير.
   2. بالنسبة لإصابة الفوتونين، قم بإعداد المعلمات التالية لتصوير GFP باستخدام ليزر الفوتونين عند 930 نانومتر (1950 ميجاوات).
      1. حدد وضع مسح الخط. افتح الثقب على طول الطريق زيادة كثافة الليزر إلى ~ 20٪ (390 كيلوواط).
      2. حدد 512 × 512 كمسح الإطار. استخدم أقصى سرعة للمسح الضوئي (عادة مع وقت البكسل عند 0.77 ميكروس). تأكد من أن متوسط عدد 1 وعمق بت هو 8 بت.
      3. تعيين الربح إلى ~ 750، والإزاحة إلى 0.
      4. حفظ هذا البروتوكول التجريبي المحدد مسبقا ك 2P GFP 930 Ablation، مما يسمح بإعادة الاستخدام السهل في التجارب المستقبلية.
   3. للتصوير البؤري، قم بإعداد المعلمات التالية لتصوير GFP باستخدام ليزر Argon عند 488 نانومتر:
      1. حدد علامة التبويب اكتساب ثم Z-المكدس.
      2. تحت "ليزر" ، بدوره على السلطة ل488 نانومتر ارجون الليزر.
      3. انتقل إلى القنوات، حدد الليزر 488 ملم ، وزيادة قوة الليزر إلى 5-10 ٪. بالنسبة للثقب، استخدم وحدة التهوية 1-2 (AU). ضبط الربح إلى 650.
      4. في وضع الاستحواذ، حدد 1024 × 1024 كمسح الإطار ، استخدم أقصى سرعة مسح ، ومتوسط عدد 2 ، وعمق بت 8 بت.
      5. حفظ هذا البروتوكول التجريبي المحدد مسبقا ك GFP Imaging.
2. تخدير اليرقات مع الأثير ديثيل وتصاعد
   1. في غطاء الدخان، ضع طبق زجاجي عيار 60 ملم في طبق بيتري بلاستيكي طوله 15 سم. أضعاف ووضع قطعة من ورق الأنسجة في الجزء السفلي من الطبق الزجاجي، ثم وضع طبق أجار عصير العنب على الأنسجة. إضافة الأثير diethyl في الطبق الزجاجي، لدرجة أن ورقة الأنسجة غارقة وهناك طبقة من الأثير السائل المتبقية في الطبق. حافظ على الغطاء في جميع الأوقات.
   2. إعداد شريحة زجاجية مع قطرة واحدة من زيت الهالوكربون 27 في المركز. إضافة 4 بقع من الشحوم فراغ على الزوايا الأربع من الشريحة، لدعم في وقت لاحق coverslip.
   3. استخدم ملقط لالتقاط يرقة نظيفة ووضعها على طبق أغار في طبق زجاجي عيار 60 ملم. قم بتغطية الطبق الزجاجي بغطاءه وانتظر حتى تتوقف اليرقة عن الحركة. بالنسبة لإصابة / تصوير PNS ، أخرج اليرقة بمجرد توقف ذيلها عن الارتعاش. بالنسبة إلى الجهاز العصبي المركزي ، انتظر حتى تصبح اليرقة بأكملها بلا حراك ، خاصة شرائح الرأس.
      ملاحظة: توقيت التعرض الأثير أمر بالغ الأهمية. راجع المناقشة.
   4. التقط بعناية اليرقة المخدرة ووضعها بشكل مستقيم في قطرة زيت الهالوكربون على الشريحة. إضافة غطاء أعلى الشريحة. استخدام ضغط لطيف لدفع لأسفل على غطاء، حتى يمس اليرقة (الشكل 1A).
   5. ضبط موقف اليرقة عن طريق دفع بلطف coverslip نحو اليسار أو اليمين للفة اليرقة، بحيث الخلايا العصبية / محور / dendrite من الفائدة على الجزء العلوي والأقرب إلى عدسة المجهر.
   6. بالنسبة لإصابة PNS ، قم بتركيب الجانب الظهري لليرقة ، بحيث تكون القصبة الهوائية مرئية. ثم لفة اليرقة ~ 30 درجة إلى اليسار لإصابة الفئة الثالثة دا محاور عصبية (الشكل 1B و 1C)، 90 درجة لإصابة الفئة الرابعة دا محاور عصبية (الشكل 1B و 1E)، أو ~ 30 درجة لإصابة الفئة الرابعة دا الخلايا العصبية dendrites (الشكل 2A).
   7. بالنسبة لإصابة الجهاز العصبي المركزي ، ضع اليرقة لتكون الجانب البطني تماما (الشكل 3A) ، بحيث تكون المنطقة ذات الاهتمام الأقرب إلى عدسة المجهر في الطائرة z.
3. الإصابة بالليزر ثنائي الفوتوان
   1. ضع الشريحة مع اليرقة تحت المجهر وتأمينها في مكانها مع حامل الشريحة على المسرح. استخدم هدف 10X (0.3 NA) للعثور على اليرقة.
   2. إضافة 1 قطرة من النفط الهدف على coverlip، والتحول إلى الهدف 40X (1.3 NA) وضبط التركيز.
   3. التبديل إلى وضع المسح الضوئي وإعادة استخدام البروتوكول التجريبي 2P GFP 930 Ablation. تأكد من فتح الثقب على طول الطريق.
      ملاحظة: يجب تحسين التكوين استنادا إلى الأنظمة الفردية.
   4. بدء تشغيل وضع Live لتحديد موقع منطقة الاهتمام (ROI) ، وضبط الإعدادات لتحقيق جودة صورة جيدة مع التكبير المناسب.
      ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو العثور على الخلايا العصبية / المحور / dendrite لإصابة ، بدلا من اتخاذ أفضل صورة ذات جودة. ولذلك، استخدم الإعدادات الدنيا كافية لتصور المنطقة المستهدفة، من أجل تجنب التعرض المفرط أو photobleaching.
   5. إيقاف الفحص المباشر، بحيث يصبح الزر Crop متوفرا. دع الصورة الثابتة بمثابة خارطة الطريق. حدد وظيفة الاقتصاص واضبط نافذة المسح الضوئي للتركيز على الهدف الذي سيتم إصابته.
   6. تقليل عائد الاستثمار ليكون حجم موقع الإصابة المحتمل. على سبيل المثال، فقط قم بتغطية عرض المحور أو التشعب، لضمان دقة الإصابة وتقليل الأضرار التي لحقت بالأنسجة المجاورة. إذا رغبت في ذلك، قم بتكبير عائد الاستثمار قبل الاقتصاص، مما يسمح بإصابة أكثر دقة.
   7. افتح نافذة تصوير جديدة. قلل من سرعة المسح الضوئي وزاد من كثافة الليزر. تحديد الزيادة في كثافة الليزر على أساس إشارة مضان الأنسجة الممسوحة ضوئيا في الوضع المباشر.
   8. عادة، تعيين كثافة الليزر اثنين الفوتون بدءا من 25٪ لإصابة PNS و 50-100٪ لإصابة VNC. بالنسبة لإصابة محور PNS، تأكد من أن كثافة الليزر تبلغ ~480 كيلوواط ووقت الشغل بكسل هو 8.19 ميكروس. بالنسبة لإصابة المحور VNC، تأكد من أن كثافة الليزر ووقت سكن البكسل عادة ما يكونان 965-1930 ميجاوات و8.19-32.77 ميكروس على التوالي.
   9. بدء الفحص المستمر. اترك المؤشر يحوم فوق الزر "مستمر". راقب الصورة عن كثب وتوقف الفحص بمجرد ملاحظة زيادة كبيرة في الفلورسينس.
      ملاحظة: ويرجع ظهور ارتفاع الفلورسينس إلى الفلورسينس التلقائي في موقع الإصابة.
   10. قم بالتبديل مرة أخرى إلى وضع Live عن طريق إعادة استخدام الإعدادات. ابحث عن منطقة الاهتمام التي تم استهدافها للتو عن طريق ضبط التركيز.
       ملاحظة: ومن المؤشرات الجيدة على الإصابة الناجحة ظهور حفرة صغيرة، أو هيكل يشبه الحلقة، أو حطام موضعي في موقع الإصابة مباشرة.
   11. الانتقال إلى الخلايا العصبية التالية وتكرار من الخطوة 1.3.5، لإصابة الخلايا العصبية متعددة في واحد. أو كرر الخطوة 1.3.5 مع زيادة الطاقة و / أو تقليل سرعة المسح الضوئي تدريجيا إذا كانت الإصابة الأولية غير كافية.
       ملاحظة: في حالة ارتفاع طاقة الليزر ، ستكون منطقة كبيرة متضررة مرئية في صورة المسح الضوئي المباشر بعد الإصابة. قد يسبب الكثير من الإصابات وفاة اليرقة.
   12. استعادة اليرقة عن طريق إزالة الغطاء بعناية ونقل اليرقة المصابة إلى طبق جديد مع معجون الخميرة. خندق عدة كهوف على لوحة أجار مع ملقط; بدلا من ذلك ، جعل جزيرة من أجار في لوحة بدلا من استخدام لوحة كاملة ، للحد من احتمال اليرقة الزحف من لوحة.
   13. وضع لوحة في طبق بيتري 60 ملم مع الأنسجة الرطبة (غارقة مع محلول حمض البروبيونيك 0.5٪) والثقافة في درجة حرارة الغرفة أو 25 درجة مئوية.
       ملاحظة: ستبقى اليرقة في مرحلة اليرقات لمدة يوم إضافي تقريبا في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) مقارنة ب 25 درجة مئوية.
4. التصوير البؤري بعد الإصابة
   1. صورة اليرقة المصابة في النقاط الزمنية المطلوبة عن طريق إعداد اليرقة باستخدام نفس إجراء التخدير وتصاعد كما هو الحال في الخطوة 1.2 ، ثم التصوير بالليزر confocal.
      ملاحظة: صورة اليرقة في 24 ساعة بعد الإصابة (الذكاء الاصطناعي) لتأكيد الإصابة المحورية وعلى 48 ساعة الذكاء الاصطناعي (الفئة الرابعة دا الخلايا العصبية) أو 72 ساعة الذكاء الاصطناعي (الفئة الثالثة دا الخلايا العصبية) لتقييم التجديد.
   2. حدد موقع اليرقة باستخدام هدف 10X ، ثم انتقل إلى هدف 25X (0.8 NA). إعادة استخدام البروتوكول التجريبي GFP التصوير.
   3. انقر على زر لايف والعثور على نفس الخلايا العصبية المصابين سابقا.
   4. تعيين المواضع Z الأول والأخير في إطار المسح الحي. اضغط إيقاف ثم انقر فوق بدء التجربة للحصول على صورة مكدس Z.
      ملاحظة: تأكد من تضمين نقطة التطبيع (نقطة تقارب المحور) عند التقاط الصور بحيث يكون تحديد كمي للتجديد ممكنا(الشكل 1D، 1F) - تتم مناقشة هذا الأمر بشكل أكبر في قسم تحليل البيانات.
   5. قم بالتبديل إلى معالجة الصور، وحدد الصورة التي تم التقاطها للتو ، وولد إسقاطا أقصى كثافة. احفظ كل من z-stack وصور الإسقاط ذات الكثافة القصوى.

Representative Results

الشكل 1: دا تجديد محور عصبي في محيط يعرض خصوصية الطبقة. (A و B) رسم تخطيطي يوضح موضع اليرقات. (ج)الرسم التخطيطي للفئة الثالثة دا الخلايا العصبية. (D) أكسونس من الفئة الثالثة دا الخلايا العصبية ddaF, المسمى مع 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, تفشل في النمو. (ه) الرسم التخطيطي للفئة الرابعة دا الخلايا العصبية. (F) أكسونس من الفئة الرابعة دا الخلايا العصبية v'ada، وصفت مع ppk-CD4-tdGFP/+، تنمو من جديد خارج موقع الآفة. (D و F) يشير الخط الأحمر إلى طول المحور بينما يشير الخط الأخضر المتقطع إلى المسافة بين جسم الخلية ونقطة التقارب المحورية (DCAC). النقطة الزرقاء تشير إلى نقطة تقارب المحور. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: دا تجديد الخلايا العصبية dendrite. (أ)التمثيل التوضيحي للفئة الرابعة دا الخلايا العصبية. (ب)تمثيل توضيحي لتجديد dendrite في الفئة الرابعة دا الخلايا العصبية ddaC، وصفت من قبل ppk-CD4-tdGFP/+. يستهدف الاستئصال بالليزر نقطة الفرع الرئيسي ويتم إجراؤه على 48 ساعة AEL. في 24 ساعة الذكاء الاصطناعي يتم تأكيد نقل إصابة neurite، وعلى 72 ساعة الذكاء الاصطناعي يتم قياس التجدد كميا. Dendrites من الخلايا العصبية ddaC تثبت إعادة نمو كبيرة، مع فروع جديدة dendritic تنبت من الجذعية المقطوعة لتجانب المساحة الشاغرة. تجدر الإشارة إلى أن فروع المحطة الجديدة تضاف باستمرار إلى التشعبات غير المصابة في هذه المرحلة التنموية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: دا تجديد محور عصبي في VNC. (أ) رسم تخطيطي ليرقات Drosophila مثبتة على شريحة ومصورة تحت المجهر. الفئة الرابعة دا محاور عصبية في VNC تصور في ppk-CD4tdGFP / + يرقة. يتم عرض مقطعي مفوضة المرشحين في الصورة المكبرة والرسم التخطيطي. كل واحد منهم لديه موقعين للإصابة (دوائر حمراء). (ب)صور كونفوجال لشريحة مصابة واحدة مصورة على بعد 8 و24 و72 ساعة بعد الإصابة (الذكاء الاصطناعي). تصور الخطوط الحمراء المحاور التي تنمو من جديد. (ج)قياس وتطبيع محاور النمو. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent