双光子激光诱导神经损伤：观察 阿 克逊退化和再生的方法

Overview

此视频描述了双光子激光消融的轴突在 甲基瓜 鼠幼虫和示例协议，以诱导伤害和图像的伤害现场。

Protocol

本协议摘自李等人，一个在 维沃 伤害模型研究神经再生的外周和中枢神经系统，J.Vis.Exp.（2018 年）。

1. 双光子损伤和共焦成像

1. 显微镜设置
   注： 这个实验使用了双光子激光的共焦激光扫描显微镜，但其他设置相等的系统也就足够了。双光子激光器（930纳米）用于输送损伤，Argon激光器（488纳米）用于GFP的共焦成像。
   1. 在每节课开始时，打开双光电子激光和/或共焦激光器和显微镜。打开成像软件。
   2. 对于双光子损伤，使用双光子激光器在 930 nm（1，950 mW）处设置以下成像 GFP 参数。
      1. 选择行扫描模式。一路打开针孔。将激光强度提高到~20%（390mW）。
      2. 选择 512 x 512 作为帧扫描。使用最大扫描速度（通常像素停留时间为 0.77 μs）。确保平均数字为 1，位深度为 8 位。
      3. 将增益设置为 750 英镑，将偏移设置为 0。
      4. 将此预设的实验协议保存为 2P GFP 930 消融，以便于将来的实验中重复使用。
   3. 对于共焦成像，使用 Argon 激光器在 488 nm 下设置以下 GFP 成像参数：
      1. 选择 收购 选项卡，然后 选择Z堆栈。
      2. 在"激光"下，打开488纳米Argon激光器的电源。
      3. 转到 通道，选择 488 毫米激光，并将激光功率增加到 5-10%。对于针孔，请使用 1-2 通风单元 （AU）。将增益调整为 650。
      4. 在 采集模式下，选择 1024 x 1024 作为帧扫描，使用最大扫描速度、平均数字 2 和位深度 8 位。
      5. 将此预设的实验协议保存为 GFP 成像。
2. 拉瓦麻醉与二乙醚和安装
   1. 在烟罩中，将一个 60 毫米的玻璃盘放在 15 厘米的塑料培养皿中。折叠并放在玻璃盘底部的纸巾上，然后在纸巾上放一个葡萄汁糖板。将二乙醚加入玻璃盘中，使纸巾浸泡，盘中还剩下一层液体乙醚。时刻保持盖子。
   2. 在中心准备一滴卤素 27 油的玻璃滑梯。在幻灯片的四个角上添加 4 个真空润滑脂点，以便以后支持盖滑。
   3. 使用钳子拿起一个清洁的幼虫，并将其放在60毫米玻璃盘的阿加板上。用盖子盖住玻璃盘，等到幼虫停止移动。对于 PNS 损伤/成像，一旦幼虫的尾巴停止抽搐，立即将其取出。对于 CNS，请等到整个幼虫变得一动不动，尤其是头部部分。
      注： 乙醚暴露的时机至关重要。请参阅讨论。
   4. 小心地拾起麻醉幼虫，直立放置在滑梯上的卤烃油滴中。在幻灯片顶部添加盖片。使用温和的压力向下推盖滑，直到它接触幼虫（图1A）。
   5. 通过轻轻地将盖片向左或向右推，以滚动幼虫来调整幼虫的位置，使感兴趣的神经元/轴突/凹痕位于顶部，最接近显微镜镜头。
   6. 对于 PNS 损伤，将幼虫的后侧向上安装，以便两个气管都可见。然后将幼虫向左滚动约30度，以伤害III类达神经元轴突（图1B和1C），90度伤害IV类达神经元轴突（图1B和1E），或约30度伤害IV类达神经元树突（图2A）。
   7. 对于 CNS 损伤，将幼虫定位为完全的腹侧向上（图 3A），以便感兴趣的区域最接近 z 平面中的显微镜镜头。
3. 双光照激光伤害
   1. 将滑梯与幼虫放在显微镜下，并与舞台上的滑梯架一起固定。使用 10X （0.3 NA） 目标找到幼虫。
   2. 在盖片上加入 1 滴目标油，切换到 40X （1.3 NA） 目标并调整对焦。
   3. 切换到扫描模式，并重复使用实验协议 2P GFP 930消融。确保针孔一直打开。
      注： 配置需要根据单个系统进行优化。
   4. 启动 实时 模式以定位感兴趣的区域 （ROI），并微调设置，通过适当的变焦实现良好的图像质量。
      注： 此步骤的目的是找到神经元/轴突/登德瑞特伤害，而不是采取最好的质量图像。因此，使用足以可视化目标区域的最小设置，以避免过度暴露或照片出血。
   5. 停止 实时 扫描，以便 作物 按钮可用。让静止图像作为路线图。选择 裁剪 功能并调整扫描窗口，以专注于受伤的目标。
   6. 将投资回报率降低到潜在伤害地点的大小。例如，只需覆盖斧头或树突的宽度，以确保伤害的精度，并减少对邻近组织的损害。如果需要，在裁剪前放大投资回报率，从而允许更精确的伤害。
   7. 打开一个新的成像窗口。降低扫描速度并增加激光强度。根据 实时 扫描的组织荧光信号确定激光强度的增加。
   8. 通常，将双光子激光强度从 PNS 损伤的 25% 和 VNC 损伤的 50-100% 开始设置。对于 PNS axon 伤害，请确保激光强度为 ~480 mW，像素停留时间为 8.19 μs。对于 VNC axon 伤害，请确保激光强度和像素停留时间通常分别为 965-1930 mW 和 8.19-32.77 μs。
   9. 开始 连续 扫描。让光标悬停在 "连续" 按钮上。密切关注图像，一旦荧光急剧增加，立即停止扫描。
      注： 荧光尖峰的出现是由于受伤部位的自动荧光。
   10. 通过重复使用设置切换回实时模式。通过调整焦点来查找仅针对感兴趣的区域。
       注： 成功受伤的一个很好的迹象是，在损伤现场出现了一个小陨石坑、环状结构或局部碎片。
   11. 移动到下一个神经元，并重复从步骤1.3.5，伤害多个神经元在一个单一的动物。或重复步骤 1.3.5，同时逐渐增加功率和/或降低扫描速度，如果初始伤害不足。
       注： 如果激光功率过高，在受伤后的实时扫描图像中将可以看到一个大的损坏区域。过多的伤害可能导致幼虫死亡。
   12. 通过小心地取出盖子，将受伤的幼虫转移到一个新的盘子里，用酵母酱来恢复幼虫。用钳子在阿加板块上挖几个洞穴：或者，在盘子里做一个阿加岛，而不是使用整个盘子，以减少幼虫爬出盘子的可能性。
   13. 将盘子放入 60 毫米的 Petri 盘中，配上湿组织（浸泡 0.5% 丙酸溶液），并在室温或 25 °C 时培养。
       注： 幼虫将在室温（22 °C）下在幼虫阶段多呆一天，而室温为25°C。
4. 受伤后共焦成像
   1. 通过使用与步骤 1.2 相同的麻醉和安装程序准备幼虫，然后使用共焦激光成像，在所需的时间点对受伤的幼虫进行成像。
      注： 将幼虫在受伤后 24 小时 （AI） 成像，以确认轴向损伤，并在 48 h AI（IV 类达神经元）或 72 h AI（III 类达神经元）处确认再生。
   2. 使用 10X 目标定位幼虫，然后切换到 25X （0.8 NA） 目标。重复使用实验协议 GFP成像。
   3. 单击 "实时 "按钮，找到以前受伤的相同神经元。
   4. 在实时扫描窗口中设置第一个和最后一个 Z 位置。按停止并单击 "开始"实验 以获取 Z 栈图像。
      注： 在捕获图像时，请确保包括一个规范化点（轴向收敛点），以便可以量化再生（图 1D， 1F）——这在数据分析部分进一步讨论。
   5. 切换到 图像处理，选择刚刚拍摄的图像，并生成最大强度投影。同时保存 z 堆栈和最大强度投影图像。

Representative Results

图1：外围的达神经元轴再生显示类特异性。 （A 和 B）显示幼虫位置的示意图图。（C） 第三类达神经元的原理图。（D） 标有 19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、回购-Gal80/+的 III 类达神经元 ddaF 的轴突无法重新生长。（E） 第四类达神经元的原理图。（F） IV 类达神经元 v'ada 的轴突，标有 ppk-CD4-tdGFP/+，重新排入病变部位之外。（D 和 F）红线表示轴龙长度，而绿色虚线表示细胞体和轴向收敛点 （DCAC） 之间的距离。蓝点标记轴向收敛点。缩放栏 = 20μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

图2：大神经元树突再生。 （A） 第四类达神经元的插图表示。（B） 第四类神经元 ddaC 中树突再生的插图表示，标签为 ppk-CD4-tdGFP/+ 。激光消融以主要分支点为目标，在 48 h AEL 下进行。在 24 h 时确认中性石的 AI 损伤转选，并在 72 h 时进行 AI 再生量化。ddaC神经元的树突显示出大量的再生，新的树突分支从被切断的茎中发芽，以瓦片的空地。值得注意的是，在这个发展阶段，新的终端分支不断被添加到未受伤的树突上。缩放栏 = 20μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

图3：VNC中的大神经元轴生成。 （A） 安装在幻灯片上的果蝇幼虫的原理图，并在显微镜下成像。VNC 中的 IV 类达神经元轴突可视化为 ppk - CD4tgfp/+ 幼虫。放大图像和示意图图中显示了两个候选小卖部段。他们每个人都有两个受伤部位（红圈）。（B） 受伤后 8、24 和 72 小时拍摄的一个受伤段的对焦图像 （AI）。红线描绘了再生轴突。（C） 测量和规范再生轴突。缩放栏 = 20μm. 请单击此处查看此图的较大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent