2光子レーザー誘発神経損傷:ショ ウジョウバエ の軸索変性と再生を観察する方法

Overview

このビデオでは、ショ ウジョウバエメラノガスター 幼虫の軸索の2光子レーザーアブレーションと、傷害を誘発し、傷害部位を画像化するためのプロトコルの例を説明しています。

Protocol

このプロトコルは、末梢および中枢神経系における神経再生を研究するためのショウジョウバエインビボ傷害モデルであるLiらからの抜粋であるJ.Vis. Exp.(2018)。

1. 二光子損傷と共焦点イメージング

1. 顕微鏡のセットアップ
   注: この実験には2光子レーザーを用いた共焦点レーザー顕微鏡を使用しましたが、同等のセットアップを備えた他のシステムでも十分です。2光子レーザー(930nm)は傷害を送達するために使用され、アルゴンレーザー(488nm)はGFPの共焦点イメージングに使用された。
   1. 各セッションの開始時に、2光子レーザーおよび/または共焦点レーザーと顕微鏡をオンにします。イメージングソフトウェアを開きます。
   2. 2光子損傷の場合は、930 nm(1,950 mW)の2光子レーザーでGFPをイメージングするための次のパラメータを設定します。
      1. 回線スキャン モードを選択します。ピンホールをずっと開けろ。レーザー強度を~20%(390mW)に増加させます。
      2. フレームスキャンとして 512 x 512 を選択します。最大スキャン速度を使用します(通常は、0.77 μsのピクセルドウェル時間を使用)。平均値が 1、ビット深度が 8 ビットであることを確認します。
      3. ゲインを~750 に設定し、オフセットを 0 に設定します。
      4. この事前設定実験プロトコルを 2P GFP 930アブレーションとして保存し、将来の実験で簡単に再利用できるようにします。
   3. 共焦点イメージングの場合、488 nmのアルゴンレーザーでGFPをイメージングするための次のパラメータを設定します。
      1. [ 取得 ] タブを選択し、 次に Z スタックを選択します。
      2. 「レーザー」の下で、488 nmアルゴンレーザーの電源を入れます。
      3. チャンネルに移動し、488 mmレーザーを選択し、レーザーパワーを5〜10%に増やします。ピンホールの場合は、1-2風通しの良いユニット(AU)を使用します。ゲインを650に調整します。
      4. 取得モードで、フレームスキャンとして 1024 x 1024 を選択し、最大スキャン速度、平均 2 の数、ビット深度 8 ビットを使用します。
      5. この事前設定された実験プロトコルを GFP イメージングとして保存します。
2. ジエチルエーテルと取り付けによる幼虫麻酔
   1. ヒュームフードに、15cmのプラスチックペトリ皿に60mmのガラス皿を入れます。ガラス皿の底にティッシュペーパーを折って置き、その後、組織の上にブドウジュース寒天プレートを置きます。ガラス皿にジエチルエーテルを加え、ティッシュペーパーが浸され、皿に液体エーテルの層が残っている。常に蓋をしてください。
   2. 中央にハロカーボン27油を1滴ずつ入れ、ガラススライドを用意します。後でカバースリップを支えるために、スライドの四隅に真空グリースの4つのスポットを追加します。
   3. 鉗子を使用して、洗浄した幼虫を拾い上げ、60mmガラス皿の寒天プレートに置きます。ガラス皿を蓋で覆い、幼虫が動かなくなるまで待ちます。PNSの傷害/画像化の場合は、尾がぴくぴくしなくなるとすぐに幼虫を取り出します。CNSの場合は、幼虫全体、特に頭部セグメントが動かなくなるまで待ちます。
      注: エーテル暴露のタイミングは重要です。「ディスカッション」を参照してください。
   4. 麻酔を受けた幼虫を慎重に拾い、スライド上のハロカーボンオイルの滴に頭を直立させます。スライドの上にカバースリップを追加します。幼虫に触れるまで、穏やかな圧力でカバースリップを押し下げます(図1A)。
   5. 対象のニューロン/軸索/樹状突起が顕微鏡レンズの上部と最も近いものになるように、カバースリップを左右に押し込んで幼虫を左右に軽く押して、幼虫の位置を調整します。
   6. PNSの損傷の場合は、両方の気管が見えるように、幼虫の側を上に取り付けます。次に、クラスIIIダニューロン軸索(図1 Bおよび1C)を負傷させるために幼虫を左に30度転がし(図1Bおよび1C)、クラスIVダニューロン軸索を負傷させる場合は90度(図1Bおよび1E)、またはクラスIVダニューロン樹型樹状突起を負傷させる場合は〜30度(図2A)。
   7. CNS損傷の場合、幼虫を完全に腹側(図3A)に配置して、対象領域がZ面の顕微鏡レンズに最も近くなるようにします。
3. 2光子レーザーによる傷害
   1. 幼虫を顕微鏡の下にスライドさせ、ステージ上のスライドホルダーで所定の位置に固定します。幼虫を見つけるために10X(0.3 NA)の目的を使用してください。
   2. カバースリップに1滴の目的油を加え、40X(1.3 NA)の目標に切り替えて焦点を調整します。
   3. スキャンモードに切り替えて、実験プロトコル 2P GFP 930アブレーションを再利用します。ピンホールがずっと開いていることを確認してください。
      注: 構成は、個々のシステムに基づいて最適化する必要があります。
   4. ライブモードを開始して対象領域(ROI)を見つけ、適切なズームで良好な画質を得るために設定を微調整します。
      注: このステップの目的は、最高品質の画像を撮るのではなく、傷つけるニューロン/軸索/樹状突起を見つけることです。したがって、露出過多や光の消光を避けるために、ターゲット領域を視覚化するのに十分な最小限の設定を使用してください。
   5. [クロップ] ボタンが使用可能になるように、ライブスキャンを停止します。静止画をロードマップとして使用します。クロップ機能を選択し、スキャンウィンドウを調整して、負傷するターゲットに焦点を合わせます。
   6. ROI を、怪我の見込み部位のサイズに縮小します。例えば、損傷の精度を確保し、隣接する組織への損傷を減らすために、軸索や樹状突起の幅をカバーするだけです。必要に応じて、トリミングする前に ROI を拡大し、より正確な損傷を可能にします。
   7. 新しいイメージングウィンドウを開きます。スキャン速度を下げ、レーザー強度を高めます。 ライブ モードでスキャンした組織蛍光信号に基づいてレーザー強度の増加を決定します。
   8. 通常、2光子レーザー強度は、PNS傷害の場合は25%、VNC傷害では50~100%から始まる。PNS軸索損傷の場合、レーザー強度が〜480 mW、ピクセルドウェル時間が8.19μsであることを確認してください。VNC軸索損傷の場合、レーザー強度とピクセル滞量時間が通常965-1930 mWおよび8.19-32.77 μsであることを確認します。
   9. 連続スキャンを開始します。カーソルを[連続]ボタンの上に置いたままにします。画像を注意深く見守り、蛍光の急激な増加が観察されるとすぐにスキャンを停止します。
      注: 蛍光スパイクの出現は、傷害部位における自己蛍光によるものである。
   10. 設定を再利用してライブモードに戻します。フォーカスを調整することで、対象となった対象地域を見つけます。
       注: 成功した傷害の良い兆候は、損傷部位に小さなクレーター、リング状の構造、または局所的な破片の出現である。
   11. 次のニューロンに移動し、ステップ1.3.5から繰り返し、単一の動物の複数のニューロンを傷つける。または、最初の損傷が不十分であった場合、徐々にパワーを増加させ、スキャン速度を低下させながら、ステップ1.3.5を繰り返します。
       注: レーザーパワーが高すぎる場合、損傷後のライブスキャン画像に大きな損傷領域が見えます。怪我が多すぎると幼虫の死を引き起こす可能性があります。
   12. 慎重にカバースリップを取り外し、酵母ペーストで新しいプレートに負傷した幼虫を移すことによって幼虫を回復します。鉗子と寒天プレート上のいくつかの洞窟を捨てる。あるいは、プレート全体を使用する代わりにプレートに寒天の島を作り、幼虫がプレートから這い出す可能性を減らします。
   13. プレートを湿ったティッシュ(0.5%プロピオン酸溶液で浸した)と60mmペトリ皿に入れ、室温または25°Cで培養します。
       注: 幼虫は25°Cと比較して室温(22°C)で約1日余分に幼虫期に残ります。
4. 傷害後の共焦点イメージング
   1. 麻酔と取り付けの手順とステップ1.2と同じ手順を使用して幼虫を準備し、その後、共焦点レーザーでイメージングすることによって、所望の時点で負傷した幼虫を画像化します。
      注: 軸索損傷を確認するために、および再生を評価するために48時間AI(クラスIVダニューロン)または72時間AI(クラスIIIダニューロン)で24時間で幼虫を画像化します。
   2. 10Xの目的を使用して幼虫を見つけ、25X(0.8 NA)の目標に切り替えます。実験プロトコル GFP イメージング を再利用する。
   3. [ライブ] ボタンをクリックして、以前に負傷した同じニューロンを見つけます。
   4. ライブスキャンウィンドウで最初と最後のZ位置を設定します。[停止]を押して[ 実験の開始 ]をクリックして、Zスタック画像を取得します。
      注: 画像をキャプチャする際に正規化ポイント(軸索収束点)が含まれていることを確認し、再生の定量化が可能であることを確認してください (図 1D, 1F)– これはデータ分析セクションで詳しく説明されています。
   5. [画像処理]に切り替え、撮影した画像を選択して最大強度投影を生成します。Z スタックと最大強度投影イメージの両方を保存します。

Representative Results

図1:周辺におけるダニューロン軸索再生はクラス特異性を示す。 (A および B)幼虫の位置を示す模式図。(C) クラス III ダニューロンの模式図。(D) クラス III ダニューロン ddaF の軸索は、19-12-Gal4、UAS-CD4-tdGFP、レポ Gal80/+でラベル付けされ、再成長に失敗する。(E) クラス IV ダニューロンの模式図。(F) クラス IV ダニューロン v'ada の軸索は、ppk-CD4-tdGFP/+と標識され、病変部位を越えて再成長する。(D および F)赤い線は軸索の長さを示し、緑の破線はセル本体と軸索収束点(DCAC)の間の距離を示します。青い点は軸索収束点を示します。スケールバー= 20 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ダニューロンデンドライト再生 (A) クラス IV ダニューロンの例示的表現。(B) クラス IV ダニューロン ddaC におけるデンドライト再生の例示表現, ppk-CD4-tdGFP/+ によって標識.レーザーアブレーションは、第一分岐点にターゲットされ、48時間AELで行われる。24時間でAI損傷性角切が確認され、72時間でAI再生が定量化される。ddaCニューロンの樹状突起は実質的な再成長を示し、新しい樹状枝が切断された茎から芽を出して空きスペースをタイル化する。この発達段階では、新しいターミナルブランチが無傷の樹状突起に継続的に追加されているのは注目に値します。スケールバー= 20 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:VNCにおけるダニューロン軸索再生(A)スライドに取り付けられ、顕微鏡下で画像化されたショウジョウバ幼虫の模式図。VNC中のクラスIVダニューロン軸索は、ppk-CD4tdGFP/+幼虫で可視化された。2 つの候補コリスン セグメントが、拡大表示画像とスケマティック図面に表示されます。それぞれ2つの傷害部位(赤い円)があります。(B)負傷後8、24、72時間(AI)で撮影された1つの負傷セグメントの共焦点画像。赤い線は、成長する軸索を描いています。(C)軸索の再成長の測定と正規化。スケールバー= 20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent