Microinjection des cellules infirmières de Drosophila : une méthode d’accouchement intracellulaire

Overview

En raison de leur grande taille et de leur organisation relativement simple, les cellules infirmières de Drosophila conviennent parfaitement aux études d’imagerie cellulaire vivante. Cette vidéo décrit une méthode de microinjection pour l’administration de composés exogènes dans les cellules, et le protocole en vedette démontre la procédure avec des sondes oligonucléotides fluorescentes appelées balises moléculaires (MBs) utilisées pour visualiser les transcriptions endogènes de l’ARNm.

Protocol

Ce protocole est extrait de Catrina et coll.,Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).

1. Conception de MBs pour l’imagerie cellulaire en direct

1. Pliez la séquence d’ARN cible pour prédire la structure secondaire de la cible de l’ARNm à l’aide de la « forme d’ARN » du serveur mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. Coller/télécharger la séquence cible au format FASTA, sélectionner 5 ou 10% de sous-optimalité (structures avec une énergie libre de pliage dans les 5 ou 10% de la valeur MFE, respectivement), et ajuster le nombre maximum de pliages calculés en conséquence (par exemple plus grand pour 10% sous-optimalité).
      REMARQUE: L’inclusion de structures secondaires sous-optimales lors de la conception des BM permet d’identifier des régions dans l’ARNm cible qui peuvent être plus souples ou plus rigides que prévu pour la structure minimale d’énergie libre (MFE), ce qui améliore la conception globale des BM adaptés à l’imagerie cellulaire vivante.
   2. Sélectionnez un « emploi immédiat » pour les cibles d’ARNm de 800 nucléotides (nt), ou un « travail par lots » pour les longueurs d’ARNm entre 801 et 8 000 nt. Enregistrez le fichier « ss-count » sous forme de fichier texte simple.
2. Utilisez le fichier « ss-count » obtenu à l’étape 1.1 comme entrée pour le programme PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) avec les paramètres souhaités, pour concevoir plusieurs MBs pour la cible d’ARNm (voir tutoriels décrivant l’utilisation du programme PinMol à https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
   1. Déterminez la spécificité de certaines BM en effectuant l’analyse BLAST : utilisez le « blastn » avec la base de données appropriée (p. ex. pour les BM spécifiques à l’ARNm oskar, utilisez la base de données « refseq-rna » et l’organisme Drosophila melanogaster).
   2. Identifier toute expression spécifique aux tissus de la cible de l’ARNm (p. ex. pour oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray ou modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) et comparer avec tous les coups positifs BLAST. Éliminer les sondes qui montrent >50% inter-homologie avec d’autres ARNM qui sont également exprimés dans le tissu / cellule d’intérêt.
3. Sélectionnez la paire fluorophore et quencher appropriée à la microscopie mise en place disponible pour effectuer l’imagerie cellulaire en direct (p. ex. Cy5/BHQ2).

2. Synthèse, purification et caractérisation mb

1. Utilisez la synthèse et la purification à l’interne comme décrit précédemment dans Bratu, Methods in Molecular Biology (2006)ou les services de fournisseurs commerciaux, pour synthétiser et purifier un à cinq MB (voir note ci-dessus), en utilisant le schéma d’étiquetage suivant : [5'(Fluorophore)-(Linker C3 ou C6)-(2'-O-methyl MB sequence)-(Quencher)3']. Purifiez les MBs en utilisant hplc en phase inverse, en interne ou en utilisant les services du fournisseur commercial.
   REMARQUE: Les phosphoramidites utilisés pour la synthèse automatiséede la sonde doivent avoir la modification ribonucléotide de 2'- O-méthyle. On peut également utiliser des chimères d’alternant l’acide nucléique verrouillé (LNA) et les modifications méthyles de 2'-Opour augmenter la stabilité d’un hybride entre un MB plus court et son ARNm cible.
2. Synthétiser les oligonucléotides d’ADN qui correspondent à la séquence de la région ciblée de l’ARN et sont donc complémentaires à la région sonde des BM, pour une utilisation in vitro caractérisation (voir étapes 2.3 à 2.5; note ci-dessus). Maximiser l’hybridation du MB avec l’imitation cible ADN-oligonucléotide, en incluant à chaque extrémité de la cible d’ADN quatre nucléotides supplémentaires, comme on le trouve dans la séquence cible de l’ARNm.
   REMARQUE: Une caractérisation plus rigoureuse de l’efficacité du MB pour détecter la séquence ciblée peut être effectuée à l’aide de cibles d’ARN synthétisées in vitro au lieu d’oligonucléotides d’ADN complémentaires.
3. Effectuez la dénaturation thermique du MB seul, mesurez sa température de fusion (Tm) et confirmez que le MB assume la forme d’épingle à cheveux désirée à la température physiologique. Nous avons observé des valeurs Tm comprises entre 60 et 90 °C.
4. Effectuer la dénaturation thermique du MB en présence de la cible oligonucléotide de l’ADN et mesurer le MB:DNA cible tm hybride, comme précédemment décrit dans Bratu, Méthodes en biologie moléculaire (2006). Un Tm entre 55 et 60 °C est désiré pour l’hybride MB:DNA.
5. Effectuez des réactions d’hybridation in vitro avec la cible oligonucléotide d’ADN correspondante, et déterminez l’efficacité de la formation hybride MB:DNA à la température physiologique, comme décrit précédemment dans Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). La cinétique d’hybridation rapide avec l’imitation cible d’ADN est désirée, cependant les MBs qui ne montrent pas l’efficacité élevée d’hybridation avec des cibles d’ADN peuvent avoir une meilleure exécution avec l’ARNm cible in vitro et/ou in vivo.

3. Dissection et préparation des chambres individuelles d’oeufs pour la microinjection

1. Nourrir les femelles nouvellement écloses et asocées pendant 2 à 3 jours avec de la pâte de levure fraîche.
2. Anesthésier les mouches sur un tampon de CO₂ et, à l’aide d’une pince à épiler fine (Dumont #5), transférer 1-2 femelles dans une goutte d’huile d’halocarbone 700 sur une feuille de couverture en verre.
3. À l’aide d’une pince à épiler, orientez la mouche avec le côté dorsal vers le haut sous un stéréomicroscope. Disséquer l’abdomen féminin en faisant une petite incision à l’extrémité postérieure et presser doucement la paire d’ovaires dans l’huile.
4. Explanter les ovaires sur une goutte d’huile sur un nouveau coverslip. Tenez doucement un ovaire avec une pince à épiler tout en pinçant les stades les plus jeunes de l’ovariole avec l’autre pince à épiler. l’ARNm oskar est activement localisé à et après la mi-oogenèse (stades > 7), et les chambres d’oeufs plus jeunes (stades < 7) sont plus difficiles à injecter et ne survivent pas aussi longtemps. Faites glisser lentement sur le glissement de couverture (avec un mouvement vers le bas) jusqu’à ce que les ovarioles individuels ou les chambres d’oeufs soient isolés et alignés verticalement. Séparez davantage les chambres d’oeufs individuelles en déplaçant les stades indésirables de la chaîne d’oeufs ovarioles.
   REMARQUE: Assurez-vous que les chambres d’oeufs taquinées individuellement ne flottent pas dans l’huile et qu’elles adhèrent au bordereau de couverture. Ceci est important à la fois pour la microinjection réussie et l’acquisition d’images.

4. Microinjection des BM dans les cellules infirmières des chambres à œufs

1. Préparer la solution MB, à l’aide d’une balise moléculaire (p. ex. osk2216Cy5), ou d’un mélange de deux MB qui ciblent différents ARNM et qui sont étiquetés avec des fluorophores spectraux distincts (p. ex. osk2216Cy5 et drongo111Cy3). Utilisez une concentration de 200-300 ng/μL chaque Mo à HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl₂ et 100 mM NaCl). Pour un cocktail de quatre MBs étiquetés avec le même fluorophore qui ciblent le même ARNm à 200 ng/μL chacun dans HybBuffer (p. ex. osk82, osk1236, osk2216). Faites tourner la solution MB immédiatement avant de charger l’aiguille pour la microinjection.
2. Sélectionnez l’objectif. Un objectif d’huile 40x est recommandé pour trouver une chambre d’oeuf appropriée et pour effectuer la microinjection.
3. Montez le coverslip avec la chambre d’oeuf disséquée sur l’étape de microscope. Mettre en place l’objectif dans la position de mise au point et identifier une chambre d’oeufs à un stade de développement moyen à tardif, qui est correctement orientée pour la microinjection (c.-à-d., avec l’axe AàP perpendiculaire à la pointe de l’aiguille pour permettre une injection facile dans une cellule infirmière proximale à l’ovocyte).
4. Chargez une aiguille (commerciale ou préparée à la maison) avec ~1 solution μL Mb (voir étape 1.1) et connectez-la au microinjecteur. Pour les microinjections dans les chambres d’oeufs de D. melanogaster, orientez l’aiguille (voir tableau des matériaux)à un angle et 45° au stade du microscope (p. ex. 30°) pour éviter de percer plusieurs cellules infirmières.
5. Installez l’injecteur avec une pression d’injection de 500-1000 hPa et une pression de compensation de 100-250 hPa (voir tableau des matériaux).
6. Déplacez lentement la scène pour apporter dans le champ de vision une zone de la goutte d’huile vide de chambres d’oeufs.
7. À l’aide du joystick micromanipulateur, abaissez doucement l’aiguille dans la goutte d’huile et concentrez sa pointe vers la périphérie du champ de vision.
8. Exécutez une fonction « propre » pour enlever l’air du bout de l’aiguille et pour s’assurer qu’il y a écoulement de l’aiguille.
9. Apportez l’aiguille à la position de la maison et concentrez-vous sur la chambre d’oeufs à microinjecter, puis ramenez l’aiguille au point et placez-la près du bord de la chambre d’oeuf.
10. Effectuer un ajustement fin de la position Z de l’objectif de sorte que la membrane séparant les cellules follicules des cellules infirmières est au point.
11. Insérez l’aiguille dans une cellule d’infirmière et effectuez l’injection pendant 2-5 s.
12. Retirez doucement l’aiguille et rétractez-la à la position de la maison.
13. Modifiez l’objectif au grossissement souhaité pour l’acquisition d’images (60-63x ou 100x), concentrez-vous sur la chambre d’oeufs et commencez l’acquisition.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing