Microiniezione di cellule infermiere Drosophila: un metodo di consegna intracellulare

Abstract

Fonte: Catrina, I. E., et al. J. Vis. Exp. (2019).

A causa delle loro grandi dimensioni e dell’organizzazione relativamente semplice, le cellule infermiere Drosophila sono ideali per gli studi di imaging di cellule vive. Questo video descrive un metodo di microiniezione per la consegna di composti esogeni nelle cellule, e il protocollo in primo piano dimostra la procedura con sonde oligonucleotidi fluorescenti chiamate fari molecolari (MB) utilizzati per visualizzare trascrizioni di mRNA endogeno.

Protocol

Questo protocollo è tratto da Catrina et al., Visualizzando e monitorando mRNA endogeni in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019). 1. Progettazione di MB per l’imaging di cellule vive Piegare la sequenza di RNA di destinazione per prevedere la struttura secondaria della destinazione dell’mRNA utilizzando la “forma RNA” dal server mfold (<a href="http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form" target="_bla…

Materials

Spectrofluorometer	Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon	n/a	Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette	Fireflysci (former Precision Cells Inc.)	701MFL
Dumont #5 tweezer	World Precision Instruments	501985	Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm	VWR	48393-048
Dissecting microscope	Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.	n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad	Genesee Scienific	59-114
Tris-HCL pH 7.5	Sigma-Aldrich	1185-53-1
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7791-18-6
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Spinning disc confocal microscope	Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.	n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera	Hamamatsu	n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator	Eppendorf Inc.	920000037
FemtoJet Microinjector	Eppendorf Inc.	920010504
Injection needle: Femtotips II	Eppendorf Inc.	930000043
Loading tip: 20 μL Microloader	Eppendorf Inc.	930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm	VWR	48393-026; 48393-172
Dry yeast	Any grocery store	n/a
Computer, > 20 GB RAM			Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing