På grunn av deres store størrelse og relativt enkle organisasjon, er Drosophila sykepleierceller ideelt egnet for levende celleavbildningsstudier. Denne videoen beskriver en mikroinjeksjonsmetode for eksogene forbindelser som leveres inn i cellene, og den omtalte protokollen demonstrerer prosedyren med fluorescerende oligonukleotidprober kalt molekylære beacons (MB) som brukes til å visualisere endogene mRNA-transkripsjoner.
Protocol
Denne protokollen er hentet fra Catrina et al.,Visualisering og sporing Endogene mRNAer i Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019). 1. Design av MB for Live Cell Imaging Brett mål-RNA-sekvensen for å forutsi mRNA-målets sekundære struktur ved hjelp av “RNA-skjemaet” fra mfoldserveren (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Foldi…
Materials
Spectrofluorometer
Fluoromax-4 Horiba-Jobin Yvon
n/a
Photon counting spectrofluorometer
Quartz cuvette
Fireflysci (former Precision Cells Inc.)
701MFL
Dumont #5 tweezer
World Precision Instruments
501985
Thin tweezers are very important to separate out the individual egg chambers
Halocarbon oil 700
Sigma-Aldrich
H8898
Cover slip No.1 22 mm x 40 mm
VWR
48393-048
Dissecting microscope
Leica MZ6 Leica Microsystems Inc.
n/a
CO2 fruit fly anesthesia pad
Genesee Scienific
59-114
Tris-HCL pH 7.5
Sigma-Aldrich
1185-53-1
Magnesium chloride
Sigma-Aldrich
7791-18-6
NaCl
Sigma-Aldrich
7647-14-5
Spinning disc confocal microscope
Leica DMI-4000B inverted microscope equipped with Yokogawa CSU 10 spinning disc Leica Microsystems Inc.
n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD camera
Hamamatsu
n/a
PatchMan NP 2 Micromanipulator
Eppendorf Inc.
920000037
FemtoJet Microinjector
Eppendorf Inc.
920010504
Injection needle: Femtotips II
Eppendorf Inc.
930000043
Loading tip: 20 μL Microloader
Eppendorf Inc.
930001007
Micro Cover glasses no. 1 or 1.5, 22 mm x 40 mm
VWR
48393-026; 48393-172
Dry yeast
Any grocery store
n/a
Computer, > 20 GB RAM
Although processing can be carried out on most computers, higher capabilities will increase the speed of the processing