فحص التعديلات الجينومية: طريقة لتحديد المسوخ التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPR في دروسوفيلا

Overview

يصف هذا الفيديو طريقة فحص لتحديد ذباب الدروزوفيلا المعدل وراثيا، والذي تم تعديل جينومه باستخدام CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 هي أداة قوية لتحرير الجينوم أحدثت ثورة في الطريقة التي يمكن للعلماء التلاعب بها جينوم الكائن الحي. في بروتوكول المثال ، سنرى كيفية تحديد المسوخ التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPR ، حيث يحل إدراج تسلسل عملية التحويل محل أول إكسون من الجين(bnl) بدون فروع ، وبالتالي إنشاء خط برنامج تشغيل خاص بالجين bnl ، bnl-LexA.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Du et al.,استراتيجية فعالة لتوليد أنظمة نسخ ثنائية خاصة بالأنسجة في Drosophila بواسطة تحرير الجينوم، J. Vis. Exp. (2018).

1. يطير علم الوراثة والفحص (الشكل 1 والشكل 2)

1. عندما تتطور الأجنة المحقونة إلى بالغين ، عبر كل ذباب G₀ واحد إلى الذباب المتوازن. حدد موازنا مناسبا للكروموسوم الذي يحتوي على الأليل المستهدف.
2. تخدير ذرية F1 من كل صليب G0 على لوحة CO₂ واختيار عشوائيا 10-20 الذكور تحت مجسمة. عبور لهم بشكل فردي إلى الإناث موازن كما هو مبين في الشكل 2.
3. عندما تفقس يرقات F2 ، اختر الأب F1 الوحيد من كل صليب واستخراج gDNA باستخدام بروتوكول إعداد الحمض النووي الجينومي ذبابة واحدة:
   1. إعداد العازلة استخراج gDNA: 10 mM تريس-Cl درجة الحموضة 8.2، 1 M M EDTA، 25 M M NaCl، تخزين في درجة حرارة الغرفة. إعداد 20 ملغ / مل بروتيناز K الأسهم الحل وتخزينها في الثلاجة.
   2. ضع كل ذبابة في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل وسم الأنبوب. الاحتفاظ في الفريزر -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   3. إعداد حجم عمل جديد من العازلة استخراج gDNA تحتوي على تركيز نهائي 200 ميكروغرام / مل من بروتيناز K.
      ملاحظة: لا تستخدم مخزن مؤقت قديم لهذه الخطوة.
   4. سحق كل ذبابة لمدة 10-15 ثانية مع طرف ماصة تحتوي على 50 ميكرولتر من العازلة سحق دون الاستغناء عن السائل. الاستغناء عن العازلة المتبقية في الأنبوب وتخلط جيدا. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
   5. وضع أنابيب في كتلة الحرارة 95 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة لتثبيط البروتين K.
   6. تدور لأسفل لمدة 5 دقائق في 10،000 × ز. تخزين التحضير في 4 درجة مئوية لمزيد من التحليل PCR.
4. استخدم نفس الأسلوب لإعداد gDNA من ذبابة Nos-Cas9 ، والتي تعمل كتحكم سلبي. أداء ثلاث خطوات شاشات PCR القائمة على تحديد الصحيح "ينتهي بها" HDR (الشكل 1، الشكل 3) باستخدام gDNA من كل ذكر F1 كقالب⁵. استخدام 1 ميكرولتر من الإعدادية الحمض النووي في نظام رد فعل PCR التالية: 10 ميكرولتر من 2x PCR ماجستير ميكس مع صبغ، 1 ميكرولتر من كل التمهيدي (10 ميكرومتر)، 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي، و 7 ميكرولتر من DDH₂O.
5. كما هو مبين في الشكل 3ألف، أداء PCR باستخدام التمهيديات fwd1 وrev1 للكشف عن وجود الإدراج أو الاستبدال ؛ أداء PCR باستخدام fwd2 وref2 التمهيديات للتحقق من الإدراج أو الاستبدال من المنطقة 3'; أداء PCR باستخدام التمهيديات M13F وrev3 للتحقق من "ينتهي في" HDR (الجدول 1C).
6. حافظ على خطوط الطيران باستخدام HDR الذي ينتهي التأكيد عليه وإنشاء مخزونات متوازنة من جيل F2. خارج إلى موازن الذباب مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى.

Representative Results

الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل لتحرير الجينوم CRISPR/Cas9 بوساطة لإنشاء نظام نسخ ثنائي. يتم الإشارة إلى المدة الزمنية التقريبية المطلوبة لكل خطوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: رسم توضيحي للفحص كريسبر وخطة الصليب الجيني لإنشاء خطوط ذبابة محررة من الجينوم. في الصلبان الوراثية، R تقف على أليل تحريرها التي هي على كروموسوم^RD 3. MKRS (TP(3;3)MRS, M(3)76A[1] kar[1] ry[2] Sb[1]، هو علامة كروموسوم^{3 rd;} TM6B (In(3LR)TM6B, Antp [Hu] e[1] Tb[1]) هو موازن كروموسوم^{3 rd.} يتم التحقق من مخزونات الذباب المحررة من الجينوم عن طريق PCR تضخيم المناطق المستهدفة من الاهتمام من الحمض النووي الجينوم المستخرج من الذباب جيل F2 أو F3 وتسلسل تحديد منتجات PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: جيل من bnl-LexA بواسطة CRISPR/Cas9 بوساطة استبدال exon. (أ) الرسم التخطيطي الذي يصور استراتيجية CRISPR/Cas9 بوساطة HDR لاستبدال exon في موقع bnl. مربع - exon; خط- إنترون; تم عرض المتبرع البديل (pDonor-bnl:LexA)واثنين من النتائج المحتملة لتقرير التنمية البشرية. وكان pDonor -bnl : LexA الميزات التالية : (1) T2A - nls - LexA : p65 (~ 1.8kb) تسلسل يحيط بها 2 كيلوبايت و 1.8 كيلو بايت طويلة الأسلحة homology (خطوط متقطعة) ، (2) ببتيد T2A الذاتي المشقوق بين المتبقية N محطة bnl exon و NLS-LexA:p65، و (3) ترجمة وقف كودون (الأحمر *) بعد NLS-LexA:p65 تسلسل. احتفظ منتج HDR بجميع التحكم النسخي وما بعد النسخ من bnl، ومن المتوقع أن يتم إنتاج بروتين LexA:p65 بنفس نمط Bnl الذاتية. تظهر الأسهم السوداء الصغيرة مواقع الربط النسبية (وليس في الحجم) من التمهيديات PCR(الجدول 1)المستخدمة للفحص من 3 خطوات أو التحقق من RT-PCR. (ب) صور هلام Agarose التي تظهر نتائج فحص PCR من 3 خطوات. تظهر منتجات PCR التي تم تضخيمها من الحمض النووي الجينومي لأربعة خطوط HDR ناجحة. السيطرة السلبية، والحمض النووي الجينومي من nos-Cas9 خط الوالدين؛ السيطرة الإيجابية، pDonor-bnl:LexA البلازميد؛ M، ماركر (سلم الحمض النووي SL2K). (ج) مثال على هلام الفحص الذي يبين منتج PCR المتوقع باستخدام التمهيديين M13F و rev3 للخطوط النهائية؛ M8-7 و M9-6 هما طرفي في خطوط; الضوابط السلبية والإيجابية، كما هو الحال في B؛ M، ماركر (NEB 1 كيلوبايت سلم الحمض النووي). (د) تحليل RT-PCR على إجمالي الحمض النووي الريبي من bnl-LexA والذباب التحكم Nos-Cas9. التمهيدي إلى الأمام يربط إلى منطقة معينة LexA، التمهيدي العكسي يربط إلى منطقة exon bnl المصب؛ ~ 440 نقطة أساس (قاعدة الزوج) تم الكشف عن نطاق التضخيم (*) من RT-PCR على bnl-LexAمرنا، ولكن ليس من الجيش الملكي النيبالي السيطرة. M، 100 نقطة أساس ماركر (NEB). مقتبس من الشكلين 2 و S1 في دو وآخرون. 2017. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أ. استنساخ وتسلسل الحمض النووي الريبي
bnl-lexA GRNA fwd	تاتاتاغاغاغاتاتسغغجتغاكتكت كغتسكتغاتغات
	مجلس التعاون الخليجيكاتكاتغاتاتاجاكاغ
bnl-lexA gRNA القس	أتتاكتكتكتاتكتاتاغاكتكتاتااكتااك سيكاتاكتاغاغ
	شركة ATcGACGTTAAATTGAAAAGGTC
T3 التمهيدي المستخدمة للتسلسل	كاتا ACCCTCACTAAAGG-3'
ملاحظة: النيوكليوتيدات المسطرة الصلبة إلى U6 المروج أو gRNA الأساسية على ناقلات pCFD4، تمت إضافة ز / ج صغيرة لمساعدة U6 النسخ تعتمد على المروج
باء - بناء الجهات المانحة لتقرير التنمية البشرية
bnl ن F_pUC19	AATTCGAGCTCGGCTCTggtctgggggaac
bnl-lexA-N-R	tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccgga مجلس التعاون الخليجيGCAGATACAAGGCCCC
lexA-F	CTactGacttgGGGGGGTcGAaGAGAACCCTGGC CCtATGCCACCCAAGAGC
lexA-R	CTAAACGAGTTTTAAGCAAACTCCC
bnl lexA-C Fwd	تاهااكتكجتاغاغاغاتغاتغغتكاك
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattggcctgg
ملاحظة: تداخل النيوكليوتيدات في رأس المال مع ناقلات pUC19 لجمعية جيبسون ، كانت النيوكليوتيدات المسطرة متتابعة لإضافة الببتيد T2A.
جيم - فحص وتسلسل تقرير التنمية البشرية
bnl-lexA scr fwd1	جي تي جي جي سياكجاكاتاكاتاك
bnl-lexA scr rev1	غاتكاغكاتكاتكاتغ
bnl-lexA scr fwd2	كاكاغاغاتغكتغغاتسك
bnl-lexA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGAGTC
ينتهي في الاختيار rev3	غكااتجتاتغكاتكاتغغتغاك
bnl-lexA seq fwd3	كاكتGTCGCCكاتاغاتاكاتاواطغ
ملاحظة: وقد استخدمت هذه التمهيديات لفحص وتسلسل PCR، وتظهر المواقع التقريبية لمواقع الربط التمهيدي في الشكل 5A كما fwd1-2 وrev1-3.
د. تحليل RT-PCR
RT-f	غاتاتغاتكتكتككتغغ
RT-r	كاتغاغاغاغاغاغاغغاغ

الجدول 1: التمهيديات المستخدمة في هذه الدراسة. (أ)التمهيديات لاستنساخ gRNA التعبير المتجه والتسلسل. (ب) التمهيديات لاستنساخ قالب المانح HDR. (ج)التمهيديات لفحص وتسلسل منتجات تقرير التنمية البشرية. (D) التمهيديات المستخدمة للتحقق RT-PCR للمنتج ليكسا-bnl ميرنا chimeric.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation