הקרנה לשינויים גנומיים: שיטה לזיהוי מוטנטים שנוצרו על ידי CRISPR בדרוזופילה

Overview

סרטון זה מתאר שיטת הקרנה לזיהוי זבובי דרוזופילה מהונדסים, שהגנום שלהם שונה באמצעות CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 הוא כלי רב עוצמה לעריכת גנום שחולל מהפכה באופן שבו מדענים יכולים לתפעל את הגנום של האורגניזם. בפרוטוקול הדוגמה, נראה כיצד לזהות מוטנטים שנוצרו על ידי CRISPR, שבהם הכנסה של רצף טראנסאקטיביזציה מחליפה את האקסון הראשון של הגן ללא ענף (bnl), ובכך יוצרת קו נהג ספציפי לגן bnl, bnl-LexA.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Du et al., אסטרטגיה יעילה ליצירת מערכות שעתוק בינאריות ספציפיות לרקמות בדרוסופילה על ידי עריכת הגנום, J. Vis. Exp. (2018).

1. טיסה וגנטיקה והקרנה (איור 1 ואיור 2)

1. כאשר העוברים המוזרקים מתפתחים למבוגרים, חוצים כל זבוב G₀ כדי לאזן זבובים. בחר איזון מתאים לכרומוזום המכיל את האלל הממוקד.
2. הרדמה את צאצאי F1 מכל צלב G0 על משטח CO₂ ולבחור באופן אקראי 10-20 זכרים תחת סטריאומיקרוסקופ. חצו אותן בנפרד אל הנקבות המאזנות, כפי שמוצג באיור 2.
3. כאשר זחלי F2 בוקעים, לבחור את האב F1 יחיד מכל צלב לחלץ gDNA באמצעות פרוטוקול הכנת DNA גנומי זבוב יחיד:
   1. הכן מאגר מיצוי gDNA: 10 mM Tris-Cl pH 8.2, 1 mM EDTA, 25 mM NaCl, לאחסן בטמפרטורת החדר. הכינו תמיסת מלאי של 20 מ"ג/מ"ל Proteinase K ואחסנו במקפיא.
   2. שים כל זבוב בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"ל ולתייג את הצינור. יש לשמור במקפיא ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   3. הכן נפח עבודה טרי של מאגר מיצוי gDNA המכיל 200 מיקרוגרם / מ"ל הריכוז הסופי של Proteinase K.
      הערה: אל תשתמש במאגר ישן עבור שלב זה.
   4. מעוך כל זבוב במשך 10-15 שניות עם קצה פיפטה המכיל 50 μL של חיץ מעוך מבלי לחלק את הנוזל. מחלקים את החיץ הנותר לתוך הצינור ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות.
   5. שים צינורות בגוש חום של 95 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות כדי להשבית את פרוטאינאס K.
   6. ספין למטה במשך 5 דקות ב 10,000 x g. אחסן את ההכנה ב 4 מעלות צלזיוס לניתוח PCR נוסף.
4. השתמש באותה שיטה כדי להכין gDNA מעוף nos-Cas9, המשמש כפקד שלילי. בצעו מסכים מבוססי PCR תלת-שלביים כדי לזהות את HDR "מסתיים" הנכון (איור 1, איור 3) באמצעות gDNA של כל זכר F1 כתבנית⁵. השתמש 1 μL של הכנת DNA במערכת תגובת PCR הבאה: 10 μL של 2x PCR מאסטר לערבב עם צבע, 1 μL של כל פריימר (10 מיקרומטר), 1 μL של תבנית DNA, ו 7 μL של ddH₂O.
5. כפי שמוצג באיור 3A, בצע PCR באמצעות פריימרים fwd1 ו- rev1 כדי להקרין את קיומו של ההוספה או ההחלפה; לבצע PCR באמצעות fwd2 ו rev2 פריימרים כדי לאמת את הכניסה או החלפה מאזור 3'; לבצע PCR באמצעות פריימרים M13F ו rev3 כדי לבדוק "קצוות" HDR (טבלה 1C).
6. שמור על קווי הטיסה עם HDR הגמור המאושר והקם מניות מאוזנות מדור ה- F2. אאוטקרוס למאזן טס שוב כדי להסיר מוטציות לא מכוונות בכרומוזומים אחרים.

Representative Results

איור 1: מבט כולל על זרימת עבודה לעריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 כדי ליצור מערכת שעתוק בינארית. משך הזמן המשוער הנדרש עבור כל שלב מצוין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: איור של הקרנת CRISPR ותוכנית הצלב הגנטית להקמת קווי זבוב ערוכים בגנום. בצלבים גנטיים, R מייצג את האלל הערוך שנמצא על הכרומוזום^{השלישי.} מקרס (באנגלית: MKRS)הוא סמן כרומוזום^{תלת-ממדי.} TM6B (In(3LR)TM6B, Antp[Hu] e[1] Tb[1]) הוא מאזן כרומוזום^{תלת-ממדי.} מניות זבובים ערוכות גנום מאומתות על ידי PCR המגבר את אזורי היעד של עניין מן ה- DNA הגנומי שחולצו או זבובים דור F2 או F3 ורצף קביעת מוצרי PCR. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: דור של bnl-LexA על ידי החלפת אקסון בתיווך CRISPR/Cas9. (א) ציור סכמטי המתאר את האסטרטגיה של ה-HDR המתווך CRISPR/Cas9 להחלפת אקסון בלוקוס bnl. קופסה - אקסון; אינטרון שורה; תורם חלופי (pDonor-bnl:LexA)ושתי תוצאות אפשריות של HDR הוצגו. pDonor-bnl:LexA היו התכונות הבאות: (1) T2A-nls-LexA:p65 (~ 1.8kb) רצף מוקף 2 kb ו 1.8 kb זרועות הומולוגיה ארוכה (קווים מקווקווים), (2) פפטיד T2A עצמית בקע בין שאריות N מסוף bnl exon ו nls-LexA:p65, ו (3) להפסיק תרגום קודון (אדום *) לאחר רצף nls-LexA:p65. מוצר HDR שמר על כל השליטה שעתוק ואחרי שעתוק של bnl, ואת החלבון LexA:p65 צפוי להיות מיוצר באותו דפוס כמו Bnl אנדוגני. חצים שחורים קטנים להראות את אתרי האיגוד היחסי (לא בקנה מידה) של פריימרים PCR (טבלה 1) המשמש להקרנה 3 שלבים או אימות RT-PCR. (ב) תמונות ג'ל אגרוז המציגות תוצאות של הקרנת PCR תלת-שלבית. מוצרי PCR המוגברים מהדנ"א הגנומי של ארבעה קווי HDR מוצלחים מוצגים; שליטה שלילית, הדנ"א הגנומי של קו ההורים nos-Cas9; שליטה חיובית, pDonor-bnl:LexA פלסמיד; M, מרקר (סולם DNA SL2K). (ג) דוגמה של ג'ל ההקרנה המציג את מוצר PCR הצפוי באמצעות פריימרים M13F ו rev3 עבור שורות קצוות; M8-7 ו- M9-6 הם שני קווים נכנסים; פקדים שליליים וחיוביים, כמו ב- B; M, מרקר (סולם DNA NEB 1 kb). (ד) ניתוח RT-PCR על RNA הכולל מ bnl-LexA ואת זבובים בקרה nos-Cas9. פריימר קדימה נקשר לאזור ספציפי של LexA, פריימר הפוך נקשר לאזור אקסון bnl במורד הזרם; ~ 440 bp (בסיס זוג) רצועת הגברה (*) זוהה מ- RT-PCR על mRNA bnl-LexA,אבל לא מן RNA הבקרה. M, סמן 100 bp (NEB). עיבוד מתוך איורים 2 ו- S1 בדו ואח '. 2017. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שיבוט רצף ושיבוט A. gRNA
bnl-לקסA gRNA fwd	טטאטאגאגאטג'יגה-גטגקטגאט
	GCCTCגטאגטאגאג
bnl-לקסA gRNA rev	אטטקטגקטאקג'יג'יגה-קטקטגהאג
	טגאגאגאטאטאגאטאטגטק
פריימר T3 המשמש לריצוף	קאטה אקטקאטהאג-3'
הערה: נוקלאוטידים הדגישו anneal כדי U6 מקדם או ליבת gRNA על וקטור pCFD4, g/c באותיות קטנות נוסף כדי לסייע U6 יחצ"ן תלוי שעתוק
ב. בניית תורמי HDR
bnl N-F_pUC19	אוטCGAGCTCGGTACtגטקטגגקטגאק
bnl-לקסA-N-R	tCCGcaagtקגטAגקטג'גטג'קטג'קה GCCCGקגאטאקאגג'ק
לקסה-אף	CTactGacttgCGGaGAtGTcגאגהמקGGC קקטג'קאקאגאגאק
לקסה-אר	CTAAאקגגאטטגטקאקטק
bnl לקס-סי Fwd	תאאאאאקטגטגאגטגגגטגטגטקאק
bnl C-R_pUC19	GCCAAGCTTGCATGCקטג'יג'קאטאטגגג
הערה: נוקלאוטידים בחפיפה הון עם וקטור pUC19 עבור הרכבת גיבסון, נוקלאוטידים הדגישו היו overhang רצף עבור תוספת פפטיד T2A.
ג. הקרנה וצ רצף HDR
bnl-לקסA scr fwd1	GTGGCGCACGCCCAATAAAC
bnl-לקסA scr rev1	גטקגקטקטקטגאטג
bnl-לקסA scr fwd2	קאגאגאטגקטגאטגאטגאט
bnl-לקסA scr rev2	CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC
rev3 של בדיקת קצוות	גקאטגקאטגאטגאק
bnl-לקסA seq fwd3	קקטגטקגקטגאטגאטאקאטג
שים לב: פריימרים אלה שימשו להקרנה ולרצף של PCR, המיקומים המשוערים של אתרי איגוד פריימר מוצגים באיור 5A כ- fwd1.2 ו- rev1.3.
ד. ניתוח RT-PCR
RT-f	גאטגאטאטקטקג'קאטקטג'ק
RT-r	צקטגגאגאגאטאגגטג

טבלה 1: פרייומרים המשמשים במחקר זה. (A) פרייומרים לשכפול וקטור ביטוי gRNA וצ רצף. (B)פריימרים לשכפול תבנית תורם HDR. (ג)פריימרים להקרנה ולרצף של מוצרי HDR. (D)פריימרים המשמשים לאימות RT-PCR של מוצר ה-MRNA של LexA-bnl.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
Primers	IDT-DNA		PCR
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation