Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- כאשר עוברים מוזרקים מתפתחים למבוגרים G0, לחצות את כל הזבובים בודדים כדי מניות איזון מתאים כדי להרחיב את הקווים הפוטנציאליים F1 CRISPR ערוך ולהיות מסוגל לעקוב אחר הירושה של השינוי הגנומי. לאחר מכן, לחצות שנבחרו באופן אקראי F1 זכרים בודדים כדי להתאים נקבות איזון כדי להיות מסוגל לשחזר צאצאים אם זכר F1 הוא חיובי עבור המוטציה.
כדי לחלץ דנ"א גנומי, מעוך את הזבוב עם קצה פיפטה המכיל חיץ מיצוי.
כעת, כאשר ה- DNA נגיש, המשך להקרנת PCR. לדוגמה, השתמש בפריימריז שנועדו להגביר אזור הכולל את הרצף החדש. רק בנוכחות השינוי ייקשר פריימר השני ומוצר PCR יוגבר. בדוגמה, נראה זבובים גדלים ומוקרנים על ידי PCR להחדרת רצף טרנסאקטיביזציה המחליף את האקסון הראשון של הגן ללא ענף.
- כאשר עוברי nos-Cas9 הוזרקו בעבר עם פלסמיד ביטוי RNA המדריך והתורם החלופי להתפתח למבוגרים, לחצות G0 טס בנפרד כדי לאזן זבובים מקו מתאים אלל ממוקד. להרדים את צאצאי F1 מכל צלב G0 על כרית פחמן דו חמצני באופן אקראי לבחור 10 עד 20 זכרים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
כאשר זחלי F2 בוקעים, בחר את האב F1 מכל צלב.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות. בעקבות הדגירה, למקם את הצינורות ב 95 מעלות צלזיוס בלוק חום במשך 1 עד 2 דקות כדי להשבית את החלבון K. לאחר ספינינג למטה במשך 5 דקות ב 10,000 פעמים גרם, לאחסן את ההכנה ב 4 מעלות צלזיוס לניתוח PCR נוסף.
בצע מסכים מבוססי PCR תלת-שלביים באמצעות פריימרים קדימה 1 והיפוך 1 למסך לקיומה של הכניסה או ההחלפה. בצע PCR באמצעות 2 פריימרים קדימה והיפוך כדי לאמת את הכניסה או ההחלפה משלושה אזורים עיקריים.
- שמור את קווי הזבוב עם HDR סוף מאושר ולהקים מניות איזון מדור F2. החוצה לחצות את המאזן טס שוב כדי להסיר כל מוטציות לא מכוונות על כרומוזומים אחרים.
