Дрозофила Виво Кальциевая визуализация: метод функциональной визуализации нейронной активности

- Для выполнения виво кальция изображений в нервной системе Drosophila, целевой экспрессии генетически закодированный индикатор кальция, таких как GCaMP, чтобы нейроны интереса. Когда нейроны огонь потенциал действия, быстрая деполяризация мембраны вызывает напряжение закрытых кальциевых каналов, чтобы открыть, что приводит к притоку внеклеточного кальция в клетку.

GCaMP является синтез белка, в котором расширение зеленого флуоресцентного белка, или EGFP, изменяется и сливается с M13 фрагмент миозин световой цепи на N-терминуса, и кальций-связывающий белок, calmodulin, на C-терминуса. Кальций связывается с calmodulin, вызывает изменения конформации в GCaMP, вызывая увеличение флуоресценции белка.

Для изменения изображения в GCaMP флуоресценции в качестве прокси для нейронной активности in vivo, подвергать области нервной системы с ожидаемой активностью. Затем, используйте флуоресцентный микроскоп, который может захватить GCaMP динамики и оснащен стимулом доставки установки. Доставка стимул, например, запах, при записи GCaMP флуоресценции в ответ нейронов.

В примере протокола, мы увидим GCaMP функциональной визуализации используется для визуализации ответов в грибных тел мозга во время обонятельного ассоциативного обучения.

- Для визуализации индикаторов кальция на основе GFP настройте лазер мультифотонного микроскопа, оснащенного инфракрасным лазером и целью погружения в воду, установлен на вибрации изолированный стол, к возбудительной длине волны 920 нанометров, и установить фильтр GFP bandpass. Использование грубой ручки регулировки, сканировать через z-оси мозга, чтобы найти область мозга интерес. размер до 512 на 512 пикселей и выберите область для сканирования, принимая во внимание рассчитанное время сканирования для каждого кадра для достижения частоты кадров не менее 4 Герц.

Для предварительной запрограммированной макропакета, способного связать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха, и начните измерение в программном обеспечении микроскопа в течение 6,25 секунд, чтобы установить базовое значение F0. В системе доставки запаха, доставить 2,5 секунды запах стимул, указанный здесь освещение светодиодов, вызванных открытием и закрытием конкретных клапанов чашки запаха, а затем 12,5 секунд записи в конце запаха смещения. Затем повторите доставку на второй и третий запах таким же образом.

Для выполнения ассоциативных кондиционирования в этой установке, используйте компьютерную систему доставки запаха, чтобы представить условный стимул плюс запах в течение 60 секунд, наряду с 12 90-вольтовые электрическим током. После 60-секундного перерыва, представить состояние стимул минус запах только в течение 60 секунд без поражения электрическим током. Измерьте пост-тренировки запах вызванных кальция переходных снова, повторяя предварительной подготовки протокол стимуляции запаха 3 минут после окончания фазы обучения. Затем, сохранить файлы изображений в соответствующем формате для более поздних изображений анализа.