C.エレガンス ゴナド押出:急速解離技術

Overview

このビデオでは、成人 C.エレガンス・ヘレガンス ・ヘルマフロダイトから生殖腺を解剖し、免疫染色および蛍光イメージングに適した組織を生じる方法について説明します。

Protocol

このプロトコルは、Gervaise と Arur からの抜粋, C. エレガンス Germline のアクティブ ERK の空間的および時間的分析.J. ヴィス・エクス(2016).

1. 生殖腺を得るための成虫の解剖

1. 100 ~ 150 WT (N2) または所望の特定の発達段階での望ましい遺伝子型のワーム (L1, L2, L3, L4, 成人 など) M9 バッファーの 100 μL の M9 バッファーを 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブで選びます。
2. マイクロ遠心分離管にM9バッファ900 μLを充填します( 材料表を参照)。マイクロ遠心分離機で1,000 x gのチューブを周囲温度で1分間遠心します。
3. M9バッファの900μLを静かに取り出し、廃棄します。解剖顕微鏡の下でバッファーを取り外して、ワームが誤って除去されないようにします。
4. 毎回、新しい M9 バッファを使用して、手順 1.2 ~ 1.3 を 2 回繰り返します。これにより、ワームと共に引き継がれた細菌が効果的に洗い流されます。
5. 最後の洗浄後、900 μL の M9 バッファーをチューブから取り出し、廃棄します。
6. 200 μL マイクロピペットチップを備えた 100 ~ 150 ワームを含む M9 バッファの残りの 100 μL を、平底ガラス時計皿に移します。使用前にマイクロピペットチップを10μLのマークで切ります。先端を切断しないと、ワームのせん断が発生します。
7. M9バッファにワームを含むガラス時計皿に0.1 Mレバミソールの1〜3μLを加えます。レバミゾールとM9をそっと旋回して、ワームが動かなくなるまで混ぜ合わせます。
   注: レバミゾールの在庫は、長期保存のために-20 °Cで保管することができます。ここで、動物における移動性の急速な喪失を得るために、0.2-0.25mMのレバミゾールの文献23に記載されているものよりも高濃度の1〜3mMを使用する。動物が液体懸濁液であまりにも長い間飛び回る場合、生殖腺中のdpERKの結果として生じるパターンは可変である可能性があります(ストレスや栄養不足、またはその両方が原因です)。解剖のための1-3 mMのレバミゾールでより再現可能な染色パターンが達成された。
8. 2本の2本の2本の2本の2本の1mLの注射器に2本のG針を取り付けます(注射器の大きさは関係ありません、針のゲージは重要です)。各手に1つのシリンジを置く(図1)。
9. 解剖顕微鏡の下で、 図1 に示すように各ワームの下と上に各針を置き、2番目の咽頭球の近くでワームに細かい切り傷をはいたような動きにします。ワームの1カット後、皿のすべての動物が少なくとも一度カットされるまで、次の動物に移動します。
   注: ステップ 1.8 ~ 1.9 は時間に敏感です。再現可能なdpERKパターンのために5分以内に皿のすべてのワームを解剖します。解剖時間が長いほど、特にゾーン1ではdpERK信号がオフになります。割り当てられた時間枠内に留まる必要がある場合は、解剖のラウンドあたりのワームの数を調整します(例えば、50ワーム 対 150)。
   1. 押し出された生殖腺が解剖中に見えない場合には、同じ動物で別の切り傷を試みないでください。通常、それは動物を剪断するだけで、生殖腺の押し出しにはなりません。代わりに、次の動物に移動します。生殖腺が押し出されないワームは、セクション6で作成されるスライドにそのように表示され、イメージング中に無視することができます
      注: すべての解剖および処理ステップを通して、生殖腺が身体/死体に付着したままであることを心に留めておいてください。針で生殖腺と体を引き離さないで下さい。しばしば、体から生殖腺を切断しようとして生殖組織の異常な裂け目は、偽の抗体シグナルをもたらす可能性があります。ボディ/カーカスは、画像撮影の手順中に無視することができ、唯一の画像のゴーナド。さらに、時には腸細胞は、アッセイされる抗体の内部制御/体細胞制御としても機能する。

図1:解剖中の針の位置のデモンストレーション。 左:プロセス中の解剖の写真。右: ワームを参照して針の位置。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flat bottom glass watch dish	Agar Scientific	AGL4161	We use glass because dissected gonads often stick to plastic
25 G needles	BD PrecisionGlide	305122
Syringes (could be 1 or 5 mL)	BD Syringes	1 mL: BD 309659
Microscope slides (25 x 75 x 1.0 mm)	Fisherbrand	12-550-343
Clinical bench top centrifuge
*M9 solution
Levamisole	Sigma	L9756
*M9 Buffer Recipe			3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L.