चार तरह से ओल्फैमीटर परख: ड्रोसोफिला में गंध-क्यूड प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक विधि

Overview

फल मक्खियों में एक जटिल घ्राण प्रणाली होती है, सैकड़ों गंधों के साथ भेदभाव कर सकती है, और सीधे व्यवहार निर्णयों के लिए गंध की अपनी भावना का उपयोग कर सकती है। यह वीडियो चार तरह के घ्राणोमीटर परख, मक्खियों में घ्राण व्यवहार प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है । विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल क्लिप से पता चलता है कि परीक्षण मक्खियों को कैसे संभालना है और परख करते समय महत्वपूर्ण कदम क्या हैं।

Protocol

यह प्रोटोकॉल लिन एट अल से एक अंश है, घ्राण व्यवहार एक चार-चतुर्भुज ओल्फैमीटर, जे विस Exp. (२०१६) में ड्रोसोफिला के कंप्यूटर ट्रैकिंग द्वारा परख ।

1. आकर्षक और प्रतिरोधी Odorants के लिए व्यवहार प्रतिक्रियाएं

1. तापमान नियंत्रक पर स्विच करें और इसे 25 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
2. गंध कक्ष के आउटलेट पर ट्यूबिंग डालकर और व्यवहार बॉक्स पर पुश-टू-कनेक्ट फिटिंग के लिए गंध कक्षों (नियंत्रण और परीक्षण गंध) को कनेक्ट करें।
3. एयरफ्लो मीटर का उपयोग करके प्रत्येक क्वाड्रेंट में प्रवाह दर की जांच करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नियंत्रण और गंध वाली एयरस्ट्रीम 100 मिलीलीटर/मिनट के बराबर हैं।
4. पीएफई फ्लाई एरिना और ग्लास प्लेटों को 70% इथेनॉल 2-3 बार साफ करें और उन्हें पूरी तरह से हवा सूखी (~ 3-4 मिनट) की अनुमति दें।
5. क्लैंप के साथ अखाड़े में कांच की प्लेटों को प्रत्यय करें।
6. ग्लास प्लेटों में से एक में छेद के माध्यम से क्षेत्र में सीओ₂ संज्ञाहरण के बिना मक्खियों को स्थानांतरित करें। स्थानांतरण के बाद, मक्खियों को बचने से रोकने के लिए छेद पर एक गोलाकार जाल रखें।
   नोट: सीओ₂ संज्ञाहरण को ड्रोसोफिला व्यवहार को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और एक व्यवहार प्रयोग के 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।
7. प्रकाश-तंग कक्ष में मक्खियों के साथ अखाड़ा रखें, व्यवहार बॉक्स पर पुश-टू-कनेक्ट फिटिंग से जुड़े ट्यूबिंग को अखाड़ा कोनों से जोड़कर चार नियंत्रण वायु धाराओं को कनेक्ट करें, कक्ष का दरवाजा बंद करें और मक्खियों को नए वातावरण में अनुकूलित करने के लिए 10-15 मिनट इंतजार करें। यदि संभव हो, तो संभावित न्यूनतम प्रकाश रिसाव से बचने के लिए, जहां प्रयोग किए जाते हैं, उस कमरे में रोशनी बंद करें जो प्रयोगात्मक परिणाम को पूर्वाग्रह कर सकता है।
8. 5-10 मिनट का नियंत्रण प्रयोग चलाएं, जिसमें मक्खियों को 4 नियंत्रण वायु धाराओं के संपर्क में रखा जाता है।
9. यह सुनिश्चित करने के लिए तुरंत डेटा का विश्लेषण करें (नीचे डेटा विश्लेषण अनुभाग देखें) यह सुनिश्चित करने के लिए कि मक्खियों को क्षेत्र में समान रूप से वितरित किया जाता है, और आकर्षण सूचकांक 0 के करीब है। यह कदम आवश्यक है, क्योंकि यह सत्यापित करता है कि अखाड़े के भीतर वरीयता या परिहार के कोई अनियंत्रित स्रोत नहीं हैं(उदाहरण के लिए बाहर से प्रकाश लीक, असमान तापमान वितरण, असमान क्षेत्र, गंध संदूषण, आदि)। यदि मक्खियों को असमान रूप से वितरित किया जाता है या उनकी लोकोमोटर गतिविधि कम है, तो मक्खियों को त्यागें, अखाड़ा को फिर से साफ करें (चरण 1.4) और प्रयोग दोहराने के लिए मक्खियों के एक नए बैच का उपयोग करें।
10. 3-तरह के वाल्व पर स्विच करके या कनेक्टर ट्यूब को फिर से प्लग करके टेस्ट गंध कक्ष को सेटअप से कनेक्ट करें।
11. 5-10 मिनट के लिए परीक्षण प्रयोग चलाएं और नीचे दिए गए सेक्शन 2(चित्रा 1)में चर्चा किए गए डेटा का विश्लेषण करें। 20 मिनट से अधिक समय तक रिकॉर्डिंग डेटा फ़ाइलों में परिणाम कर सकते हैं जिन्हें गणना प्रक्रिया में मुश्किल हो सकती है। यदि अब प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग वांछित हैं, तो ट्रैकिंग प्रोग्राम को तेजी से रोकें और फिर से शुरू करें। इसके परिणामस्वरूप प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग के बीच ~ 10 सेकंड का अंतर होता है।
12. मक्खियों को त्यागें।
13. 70% इथेनॉल (चरण 1.4) के साथ साफ क्षेत्र और ग्लास प्लेटें और प्रकाश-तंग बाड़े के भीतर कनेक्टर ट्यूबों को बदलें। प्रयोगों में तेजी लाने के लिए, एक नया स्वच्छ क्षेत्र इस्तेमाल किया जा सकता है, और गंदा अखाड़ा प्रायोगिक रन प्रदर्शन करते हुए साफ ।
14. यदि आवश्यक हो तो मक्खियों के एक नए बैच के साथ एक और प्रयोग चलाएं। यदि एक ही दिन कई प्रयोग चलाए जाते हैं, तो यह सुनिश्चित करने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतें कि पिछले परीक्षण रन से सिस्टम में कोई गंध नहीं बचा है। यह आम तौर पर गंध की कम सांद्रता या सीओ₂के साथ एक समस्या नहीं है, लेकिन प्रयोगात्मक रन के बीच 24 घंटे के अंतर तक अत्यधिक केंद्रित उत्तेजनाओं के लिए आवश्यक हो सकता है। इसके अलावा, प्रवाह-ट्यूबों के बाद सभी ट्यूबिंग को बदला जा सकता है यदि नियंत्रण प्रयोगों के दौरान गंध संदूषण की आशंका है। सिस्टम को लगातार फ्लश करने के लिए प्रयोगों के बीच हमेशा सूखी हवा छोड़ दें।

2. डेटा विश्लेषण

नोट: सुझाए गए फ्लाई ट्रैकिंग अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री में विस्तृत), अधिग्रहण के दौरान वास्तविक समय में मक्खियों को ट्रैक करता है, और * .dat प्रारूप में सभी पता लगाया मक्खियों के समय स्टांप और निर्देशांक बचाता है। हमने डेटा को मैटलैब प्रारूप में बदलने और डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक कस्टम-निर्मित मैटलैब दिनचर्या विकसित की है। पूरक सामग्री में कोड उदाहरण प्रदान किए जाते हैं, लेकिन कार्यान्वयन का विवरण डेटा अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ्टवेयर पर निर्भर करेगा।

1. कच्चे डेटा लोड करें। एक स्थानिक मुखौटा बनाएं जो क्षेत्र की रूपरेखा का पालन करता है और क्षेत्र के बाहर आने वाले सभी डेटा बिंदुओं को हटाने के लिए कच्चे डेटा पर मुखौटा लागू करता है क्योंकि वे शोर का प्रतिनिधित्व करतेहैं (चित्रा 2ए, पूरक कोड मास्कस्पेशियलफ़िल्टरिंग.m, स्कोर.m, ड्रासर्कुलरमास्क.m)।
2. 3s से अधिक समय तक 0.163 सेमी/एस से नीचे की गति से चलने वाले सभी डेटा बिंदुओं को हटा दें, क्योंकि यह डेटा गैर-चलती मक्खियों(चित्रा 2बी, पूरक कोड अस्थायी फिल्टरिंग.m) द्वारा शोर या उत्पन्न होने की संभावना है।
3. शेष डेटा बिंदुओं को एक बार या एकल प्रक्षेप पथ(चित्रा 1, पूरक कोड सिंगलट्राजेक्टरीव्यूअर.m) के रूप में प्लॉट करके कल्पना करें।
   नोट: चार क्षेत्रों में गंध सीमाओं का स्थान कई कारकों पर निर्भर करता है, जैसे कि प्रत्येक गंध की विशेषताएं और एयरफ्लो दरों का उपयोग किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, अत्यधिक अस्थिर गंध की संभावना गंध चतुर्भुज को कम अस्थिर गंधों की तुलना में अधिक पूरी तरह से भर देगी। इस प्रकार, यह संभावना है कि प्रत्येक गंध थोड़ा अलग गंध सीमाओं का प्रदर्शन कर सकते हैं। गंध सीमाओं को मापने के लिए एक फोटोियोनाइजेशन डिटेक्टर का उपयोग समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि यह एक विशेष स्थान से हवा का नमूना लेने के लिए वैक्यूम का उपयोग करता है, और इसलिए उस स्थान पर गंध एकाग्रता को बाधित करता है। बहरहाल, गंध सीमाओं जल्दी से मक्खी व्यवहार डेटा के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विभिन्न गंधों के प्रत्युत्तर में संचयी फ्लाई ट्रैक के आधार पर एक गंध सीमा को चित्र 1सी और 1 डी में स्पष्ट रूप से देखाजा सकता है।
4. यह निर्धारित करने के लिए एक आकर्षण सूचकांक की गणना करें कि क्या नियंत्रण प्रयोग कोई वरीयता प्रतिक्रिया उत्पन्न नहीं करते हैं, और गंध (या ऑप्टोजेनेटिक) उत्तेजना की प्रतिक्रिया तक पहुंचने के लिए भी। एक आकर्षण सूचकांक (एआई) की गणना करने के लिए, नियंत्रण या परीक्षण रिकॉर्डिंग के अंतिम 5 मिनट का उपयोग करें। आकर्षण का एक उपाय प्राप्त करने के लिए जो +1 (पूर्ण आकर्षण) और -1 (पूर्ण प्रतिकर्षण) के बीच पड़ता है, निम्नलिखित सूत्र का उपयोग एआई की गणना करने के लिए किया जाता है:
   
   जहां एन_{टेस्ट} टेस्ट क्वाड्रेंट में डेटा पॉइंट्स की संख्या होती है, एन_{कंट्रोल} तीन कंट्रोल क्वाड्रेंट में डेटा पॉइंट्स की औसत संख्या होती है । यह उपाय सहज है क्योंकि शून्य मूल्यों द्वारा कोई वरीयता नहीं दी जाएगी। हालांकि, यह गंधक चक्र में स्थित मक्खियों की कुल संख्या के अनुपात को सही ढंग से इंगित नहीं करता है। इस उपाय को प्राप्त करने के लिए, एक प्रतिशत सूचकांक (पीआई) का उपयोग किया जा सकता है:
   
   जहां एन_{टेस्ट टेस्ट} क्वाड्रेंट में डेटा पॉइंट्स की संख्या है, और एन _टोटल सभी चार क्वाड्रेंट में डेटा पॉइंट्स की कुल संख्या है । यह सूत्र एक उपाय प्रदान करता है जो 0 से 1 के बीच पड़ता है, 0.25 के साथ कोई व्यवहार वरीयता नहीं है(चित्रा 1ई और 2C, पूरक कोड आकर्षणइंडेक्स.m)।
5. प्रत्येक दोहराने के लिए मक्खियों के एक नए समूह का उपयोग करके प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति के 5-10 दोहराता चलाएं। कोल्मोगोरोव-स्मिनोव गैर-पैरामेट्रिक परीक्षण(चित्रा 1एफ,मैटलैब में kstest2 समारोह) का उपयोग करके स्थितियों के बीच या नियंत्रण के खिलाफ आकर्षण अनुक्रमित की तुलना करें।

Representative Results

चित्रा 1: चार-फ़ील्ड घ्राण परख का उपयोग करके उत्पन्न उदाहरण डेटा। (क)चार क्षेत्र के अखाड़े की योजनाबद्ध । (ख)तटस्थ प्रतिक्रियाएं तब देखी जाती हैं जब सभी चार क्वाड्रंट्स में केवल शुष्क वायु परफ्यूजन होता है । (ग)बाएं ऊपरी क्वाड्रेंट से पेर्फस्ड ऐप्पल साइडर सिरका के 6.25% कमजोर पड़ने के लिए आकर्षण प्रतिक्रियाएं। (घ)प्रतिकर्षण व्यवहार 10% एथिल प्रोपियोनेट से शुरू होता है। चित्रा 2B-2D में, अधिग्रहीत डेटा से एक ही प्रक्षेपवक्र की साजिश रची जाती है। एक रंग ढाल का उपयोग रिकॉर्डिंग के समय पाठ्यक्रम को दर्शाता है, नीले और लाल रंग क्रमशः रिकॉर्डिंग की शुरुआत और अंत के साथ। (ई)आकर्षण सूचकांक (एआई) और प्रतिशत सूचकांक (पीआई) की तुलना । (एफ)औसत एआई के 3-6 प्रयोगों में कोई गंध (नियंत्रण), ऐप्पल साइडर सिरका (एसीवी) और 10% एथिल प्रोपरोनेट (ईपी) नहीं है। त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है SEM. सांख्यिकीय अंतर कोल्मोगोरोव-Smirnov परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 2: डेटा विश्लेषण चरणों द्वारा उत्पन्न उदाहरण डेटा। (A)मास्कस्पेशियल फ़िल्टरिंग द्वारा किए गए डेटा की स्थानिक फ़िल्टरिंग.m क्षेत्र के बाहर आने वाले डेटा बिंदुओं को हटाने के लिए। लाल घेरे उन हलकों की प्रारंभिक स्थिति दिखाते हैं जिनका उपयोग क्षेत्र की सीमाओं को परिभाषित करने के लिए किया जाता है। काले घेरे अंतिम पदों, डेटा (चार क्षेत्र के अंदर ग्रे छायांकित क्षेत्र) के लिए सर्कल रूपरेखा फिटिंग द्वारा अधिग्रहीत कर रहे हैं । लाल डॉट्स और ब्लैक एरोहेड डेटा पॉइंट्स को इंगित करते हैं जो इस फ़िल्टरिंग स्टेप के बाद डेटासेट से हटा दिए जाएंगे। (ख)टेम्पोरल फ़िल्टरिंग द्वारा किए गए डेटा की अस्थायी फ़िल्टरिंग.m। यह फ़िल्टरिंग चरण डेटा बिंदुओं को हटा देता है जो बहुत धीरे-धीरे चलते हैं या बिल्कुल नहीं, क्योंकि वे गैर-चलती मक्खियों या क्षेत्र से गंदगी/प्रतिबिंब द्वारा उत्पन्न होने की संभावना रखते हैं। एक धराशायी लाल बॉक्स से घिरा एक लाल डॉट समान निर्देशांक के साथ ~ 6,000 डेटा अंक की स्थिति को इंगित करता है जिसे इस फ़िल्टरिंग चरण द्वारा हटा दिया जाएगा। (C)आकर्षण सूचकांक (एआई) और प्रतिशत सूचकांक (पीआई), आकर्षणइंडेक्स.m द्वारा एक प्रयोग के अंतिम 5 मिनट में 10 सेकंड के डिब्बे में गणना की गई । इन अनुक्रमित के लौकिक प्रोफाइल व्यवहार प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता के बारे में जानकारी होते हैं और व्यवहार के विस्तृत विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक कोड फाइल। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें) ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1