Ensayo de olfactómetro de cuatro vías: un método para evaluar las respuestas de los olores en Drosophila

Overview

Las moscas de la fruta tienen un complejo sistema olfativo, pueden discriminar a cientos de olores y usar su sentido del olfato para dirigir las decisiones conductuales. Este video describe el ensayo de cuatro vías del ofactómetro, un método para estudiar las respuestas olfativas del comportamiento en las moscas. El clip de protocolo destacado muestra cómo manejar las moscas de prueba y cuáles son los pasos críticos durante la realización del ensayo.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Lin et al., Comportamientos olfativos a los que se dice por Computer Tracking Of Drosophila en un Olfactómetro de Cuatro Cuadrantes, J. Vis. Exp. (2016).

1. Respuestas conductuales a olores atractivos y repelentes

1. Encienda el controlador de temperatura y ójelo en 25 °C.
2. Conecte las cámaras de olor (olores de control y prueba) insertando el tubo a la salida de la cámara de olor y al accesorio push-to-connect en la caja de comportamiento.
3. Compruebe el caudal en cada cuadrante utilizando el medidor de flujo de aire para asegurarse de que el control y las corrientes de aire de olor son iguales a 100 ml/min.
4. Limpie la arena de vuelo de PTFE y las placas de vidrio con 70% etanol 2-3 veces y déjelos secar completamente al aire (~3-4 min).
5. Coloque las placas de vidrio en la arena con abrazaderas.
6. Transfiera moscas sin anestesia de CO₂ a la arena a través del agujero en una de las placas de vidrio. Después de la transferencia, coloque una malla circular en el agujero para evitar que las moscas escapen.
   NOTA: Se ha demostrado que la anestesia de CO₂ afecta el comportamiento de Drosophila y no debe utilizarse dentro de las 24 horas posteriores a un experimento conductual.
7. Coloque la arena con moscas en la cámara hermética, conecte las cuatro corrientes de aire de control conectando el tubo unido al accesorio push-to-connect en la caja de comportamiento a las esquinas de la arena, cierre la puerta de la cámara y espere 10-15 minutos para dejar que las moscas se aclimatan al nuevo entorno. Si es posible, apague las luces en la habitación donde se realizan los experimentos, para evitar posibles fugas mínimas de luz que puedan sesgar el resultado experimental.
8. Lleva a cabo un experimento de control de 5-10 minutos, en el que las moscas están expuestas a 4 flujos de aire de control.
9. Analice los datos inmediatamente (consulte la sección Análisis de datos a continuación) para asegurarse de que las moscas se distribuyen uniformemente en la arena y el índice de atracción está cerca de 0. Este paso es esencial, ya que verifica que no haya fuentes de preferencia o evitación incontroladas dentro de la arena(por ejemplo, fugas de luz desde el exterior, distribución desigual de la temperatura, arena irregular, contaminación por olor, etc.). Si las moscas se distribuyen de manera desigual o su actividad locomotora es baja, deseche las moscas, limpie la arena de nuevo (Paso 1.4) y utilice un nuevo lote de moscas para repetir el experimento.
10. Conecte la cámara de odorante de prueba a la configuración encendiendo las válvulas de 3 vías o volviendo a conectar los tubos del conector.
11. Ejecute el experimento de prueba durante 5-10 min y analice los datos como se describe en la sección 2 a continuación (Figura 1). Las grabaciones de más de 20 min pueden dar lugar a archivos de datos que pueden ser difíciles de procesar computacionalmente. Si se desean grabaciones experimentales más largas, detenga y vuelva a iniciar rápidamente el programa de seguimiento. Esto resulta en una brecha de ~ 10 segundos entre grabaciones experimentales.
12. Desecha moscas.
13. Limpie la arena y las placas de vidrio con un 70% de etanol (paso 1.4) y reemplace los tubos del conector dentro de la carcasa hermética. Para acelerar los experimentos, se puede utilizar una nueva arena limpia y limpiar la arena sucia mientras se realizan carreras experimentales.
14. Ejecute otro experimento con un nuevo lote de moscas, si es necesario. Si se ejecutan varios experimentos el mismo día, tener mucho cuidado para asegurarse de que no se deja ningún olor en el sistema de una ejecución de prueba anterior. Esto normalmente no es un problema con bajas concentraciones de olores o con CO_2,pero para estímulos altamente concentrados hasta una brecha de 24 horas entre las carreras experimentales puede ser necesario. Además, todos los tubos después de los tubos de flujo se pueden reemplazar si se sospecha contaminación por olor durante los experimentos de control. Deje siempre el aire seco entre los experimentos para enjuagar continuamente el sistema.

2. Análisis de datos

NOTA: El software sugerido de adquisición de seguimiento de moscas (detallado en Materiales), rastrea las moscas en tiempo real durante la adquisición, y ahorra la marca de tiempo y las coordenadas de todas las moscas detectadas en formato *.dat. Hemos desarrollado una rutina matlab hecha a medida para convertir los datos en un formato Matlab, y para analizar los datos. Los ejemplos de código se proporcionan en materiales suplementarios, pero los detalles de la implementación dependerán del software utilizado para la adquisición de datos.

1. Cargue los datos sin procesar. Cree una máscara espacial que siga los contornos de la arena y aplique la máscara a los datos sin procesar para eliminar todos los puntos de datos que se encuentran fuera de la arena, ya que representan ruido(Figura 2A,Máscara de código suplementario.m, Puntuación.m, Máscara drawcircular.m).
2. Elimine todos los puntos de datos que se mueven a una velocidad inferior a 0,163 cm/s durante más de 3s, ya que es probable que estos datos sean ruido o generados por moscas no móviles(Figura 2B, Código Suplementario TemporalFiltering.m).
3. Visualice los puntos de datos restantes trazando todos a la vez o como trayectorias individuales (Figura 1, Código suplementario SingleTrajectoryViewer.m).
   NOTA: La ubicación de los límites de olor en los cuatro campos probablemente depende de una serie de factores, como las características de cada olor y las velocidades de flujo de aire que se utilizan. Por ejemplo, los olores altamente volátiles probablemente llenarán el cuadrante de olores más completamente que los olores menos volátiles. Por lo tanto, es probable que cada olor pueda exhibir límites de olor ligeramente diferentes. El uso de un detector de fotoionización para medir los límites del olor puede ser problemático, ya que utiliza un vacío para muestrear el aire desde un punto en particular, y por lo tanto interrumpe la concentración de olores en ese lugar. No obstante, los límites de olor se pueden estimar rápidamente en función de los datos de comportamiento de las moscas. Por ejemplo, se puede observar claramente un contorno de olor basado en pistas de mosca acumuladas en respuesta a diferentes olores en las figuras 1C y 1D.
4. Calcule un índice de atracción para determinar si los experimentos de control no generan respuesta de preferencia y también para acceder a la respuesta a un estímulo de olor (u optogenético). Para calcular un índice de atracción (IA), utilice los últimos 5 minutos de un control o registro de prueba. Para obtener una medida de atracción que cae entre +1 (atracción absoluta) y -1 (repulsión absoluta), se utiliza la siguiente fórmula para calcular la IA:
   
   donde la_prueba N es el número de puntos de datos en el cuadrante de prueba, el _control N es el número medio de puntos de datos en los tres cuadrantes de control. Esta medida es intuitiva, ya que ningún tipo de preferencia estaría indicada por valores cercanos a cero. Sin embargo, no indica correctamente la proporción del número total de moscas que se encuentran en el cuadrante odorante. Para obtener esta medida, se puede utilizar un Índice de Porcentaje (PI):
   
   donde la_prueba N es el número de puntos de datos en el cuadrante de prueba, y N _total es el número total de puntos de datos en los cuatro cuadrantes. Esta fórmula proporciona una medida que cae entre 0 y 1, con 0,25 correspondiente a ninguna preferencia de comportamiento(Figura 1E y 2C, Código Suplementario AttractionIndex.m).
5. Ejecute 5-10 repeticiones de cada condición experimental, utilizando un nuevo grupo de moscas para cada repetición. Compare los índices de atracción entre condiciones o contra controles mediante la prueba no paramétrica Kolmogorov-Smirnov(figura 1F, función kstest2 en Matlab).

Representative Results

Figura 1: Ejemplo de datos generados mediante un ensayo olfativo de cuatro campos. (A) Esquema de la arena de cuatro campos. B) Se observan respuestas neutras cuando los cuatro cuadrantes contienen únicamente perfusión de aire seco. (C) Respuestas de atracción a una dilución del 6,25% del vinagre de sidra de manzana perfundido desde el cuadrante superior izquierdo. (D) Comportamientos de repulsión desencadenados por un propionato etílico del 10%. En la Figura 2B-2D, se traza una sola trayectoria a partir de los datos adquiridos. Un degradado de color se utiliza para significar el curso de tiempo de grabación, con colores azules y rojos siendo el inicio y el final de las grabaciones, respectivamente. (E) Comparación del Índice de Atracción (IA) y el Índice de Porcentaje (PI). (F) IA promedio de 3- 6 experimentos sin olor (Control), Vinagre de Sidra de Manzana (ACV) y 10% Propionato etílico (EP). Las barras de error indican QUE LAM. La diferencia estadística fue evaluada por la prueba Kolmogorov-Smirnov. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplo de datos generados por los pasos de análisis de datos. (A) Filtrado espacial de los datos, realizado por MaskSpatialFiltering.m para eliminar los puntos de datos que quedan fuera de la arena. Los círculos rojos muestran las posiciones iniciales de los círculos que se utilizan para definir los bordes de la arena. Los círculos negros son las posiciones finales, adquiridas ajustando los contornos del círculo a los datos (área de sombra gris dentro del campo de cuatro). Los puntos rojos y las puntas de flecha negras indican los puntos de datos que se quitarán del conjunto de datos después de este paso de filtrado. (B) Filtrado temporal de datos, realizado por TemporalFiltering.m. Este paso de filtrado elimina los puntos de datos que se mueven muy lentamente o no en absoluto, ya que es probable que sean generados por moscas no móviles o por suciedad / reflejos de la arena. Un punto rojo rodeado por un cuadro rojo discontinuo indica posiciones de ~6.000 puntos de datos con coordenadas idénticas que se eliminarán mediante este paso de filtrado. (C) Índice de atracción (IA) e Índice porcentual (PI), calculado en contenedores de 10 s en los últimos 5 minutos de un experimento de AttractionIndex.m. Los perfiles temporales de estos índices contienen información sobre la dinámica de las respuestas conductuales y se pueden usar para un análisis detallado de los comportamientos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de código complementario. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air delivery system			(Quantity needed)
Tubing and connectors
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Air pressure regulator, air filter and flowmeters			(Quantity needed)
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
Fly arena, camera and behavior boxes			(Quantity needed)
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging system			(Quantity needed)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(http://www.theimagingsource.com/)
Miscellaneous			(Quantity needed)
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1