Fire-vejs Olfactometer Assay: En metode til at vurdere Lugt-Cued Svar i Drosophila

Abstract

Kilde: Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors analyseret af Computer Tracking af Drosophila i en fire-kvadrant Olfactometer. J. Vis. Exp. (2016).

Frugtfluer har et komplekst olfaktorisk system, kan diskriminere hundreder af lugtstoffer og bruge deres lugtesans til direkte adfærdsmæssige beslutninger. Denne video beskriver de fire-vejs olfactometer assay, en metode til at studere olfaktoriske adfærdsmæssige reaktioner i fluer. Det fremhævede protokolklip viser, hvordan man håndterer testfluer, og hvad der er kritiske trin, mens du udfører analysen.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Lin et al., Olfactory Behaviors analyseret af Computer Tracking Of Drosophila i et firekvadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Adfærdsmæssige reaktioner på attraktive og frastødende lugtstoffer

1. Tænd for temperaturregulatoren, og sæt den til 25 °C.
2. Tilslut lugtkamrene (kontrol og test lugtstoffer) ved at indsætte slangen til udløbet af lugtkammeret og til push-to-connect-monteringen på adfærdsboksen.
3. Kontroller strømningshastigheden i hver kvadrant ved hjælp af luftstrømsmåleren for at sikre, at kontrol- og lugtluftstrømmene er lig med 100 ml/min.
4. Rengør PTFE flyve arena og glasplader med 70% ethanol 2-3 gange og give dem mulighed for fuldt lufttørre (~ 3-4 min).
5. Sæt glaspladerne på arenaen med klemmer.
6. Overfør fluer uden CO 2-anæstesi ind i arenaen gennem hullet i en af glaspladerne. Efter overførslen skal du placere et cirkulært net på hullet for at forhindre fluer i at undslippe.
   BEMÆRK: CO₂ anæstesi har vist sig at påvirke Drosophila adfærd og bør ikke anvendes inden for 24 timer af en adfærdsmæssig eksperiment.
7. Placer arenaen med fluer ind i det lystætte kammer, tilslut de fire kontrolluftstrømme ved at forbinde slangen, der er fastgjort til push-to-connect-monteringen på adfærdsboksen, til arenahjørnerne, luk døren til kammeret og vent 10-15 minutter for at lade fluerne akklimatisere sig til det nye miljø. Hvis det er muligt, skal du slukke lyset i det rum, hvor forsøgene udføres, for at undgå en mulig minimal lyslækage, der kan bias det eksperimentelle resultat.
8. Kør et 5-10 minutters kontroleksperiment, hvor fluer udsættes for 4 kontrolluftstrømme.
9. Analyser dataene med det samme (se afsnittet Dataanalyse nedenfor) for at sikre, at fluerne fordeles ensartet i arenaen, og Attraction Index er tæt på 0. Dette trin er vigtigt, da det verificerer, at der ikke er ukontrollerede kilder til præference eller undgåelse inden for arenaen(f.eks. lys, der lækker udefra, ujævn temperaturfordeling, ujævn arena, lugtforurening osv.). Hvis fluerne fordeles ulige, eller deres bevægelsesaktivitet er lav, skal du kassere fluerne, rengøre arenaen igen (trin 1.4) og bruge et nyt parti fluer til at gentage eksperimentet.
10. Tilslut testlugtkammeret til opsætningen ved at tænde for 3-vejs ventilerne eller tilslutte stikrørene igen.
11. Kør testeksperimentet i 5-10 minutter, og analysér dataene som beskrevet i afsnit 2 nedenfor (Figur 1). Optagelser, der er længere end 20 minutter, kan resultere i datafiler, der kan være vanskelige at behandle beregningsmæssigt. Hvis der ønskes længere eksperimentelle optagelser, skal du hurtigt stoppe og starte sporingsprogrammet igen. Dette resulterer i en ~ 10 sek kløft mellem eksperimentelle optagelser.
12. Kassér fluer.
13. Rengør arena- og glasplader med 70 % ethanol (trin 1.4), og udskift stikrørene i det lystætte kabinet. For at fremskynde eksperimenter kan der bruges en ny ren arena, og den beskidte arena rengøres, mens du udfører eksperimentelle løb.
14. Kør et andet eksperiment med et nyt parti fluer, hvis det kræves. Hvis der køres flere eksperimenter samme dag, skal du være yderst omhyggelig med at sikre, at der ikke efterlades lugtstof i systemet fra en tidligere testkørsel. Dette er normalt ikke et problem med lave koncentrationer af lugtstoffer eller med CO₂, men for stærkt koncentrerede stimuli kan der være behov for op til en 24 timers mellemrum mellem eksperimentelle kørsler. Derudover kan al slange efter flowrørene udskiftes, hvis der er mistanke om lugtforurening under kontrolforsøg. Lad altid den tørre luft være tændt mellem forsøgene for løbende at skylle systemet.

2. Dataanalyse

BEMÆRK: Den foreslåede flyve tracking erhvervelse software (detaljeret i materialer), spor flyver i realtid under erhvervelsen, og sparer tidsstempel og koordinater for alle opdaget fluer i * .dat format. Vi har udviklet en skræddersyet Matlab-rutine til at konvertere dataene til et Matlab-format og til at analysere dataene. Kodeeksempler findes i Supplerende materialer, men implementeringsoplysninger afhænger af den software, der bruges til dataindsamling.

1. Indlæs de rå data. Opret en rumlig maske, der følger arenaens konturer, og anvend masken på de rå data for at fjerne alle datapunkter, der falder uden for arenaen, da de repræsenterer støj (Figur 2A, Supplerende kodemaskeSpatialFiltrering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Fjern alle datapunkter, der bevæger sig med en hastighed under 0,163 cm/s i mere end 3'ere, da disse data sandsynligvis vil være støj eller genereret af ikke-bevægelige fluer (Figur 2B, Supplerende kode TemporalFiltering.m).
3. Visualiser de resterende datapunkter ved at afbilde dem alle på én gang eller som enkeltbaner (Figur 1, Supplerende kode SingleTrajectoryViewer.m).
   BEMÆRK: Placeringen af lugtgrænser i de fire felt afhænger sandsynligvis af en række faktorer, såsom egenskaberne ved hvert lugtstof og de luftstrømshastigheder, der anvendes. For eksempel vil meget flygtige lugtstoffer sandsynligvis fylde lugtkvadranten mere fuldt ud end mindre flygtige lugtstoffer. Således er det sandsynligt, at hver lugt kan udvise lidt forskellige lugtgrænser. Brugen af en fotoioniseringsdetektor til måling af lugtgrænser kan være problematisk, da den bruger et vakuum til at prøve luft fra et bestemt sted og dermed forstyrrer lugtkoncentrationen på dette sted. Ikke desto mindre kan lugtgrænser hurtigt estimeres baseret på flyveadfærdsdata. For eksempel kan en lugtgrænse baseret på kumulerede flyvespor som reaktion på forskellige lugte tydeligt observeres i figur 1C og 1D.
4. Beregn et attraktionsindeks for at afgøre, om kontroleksperimenter ikke genererer noget præferencerespons, og også for at få adgang til reaktionen på en lugtstof (eller optogenetisk) stimulus. Hvis du vil beregne et Attraction Index (AI), skal du bruge de sidste 5 minutter af en kontrol- eller testoptagelse. For at opnå et mål for tiltrækning, der falder mellem +1 (absolut attraktion) og -1 (absolut frastødning), bruges følgende formel til at beregne AI:
   
   hvor _N-test er antallet af datapunkter i testkvadranten, er _N-styring det gennemsnitlige antal datapunkter i de tre kontrolkvadranter. Denne foranstaltning er intuitiv, da ingen præference ville blive angivet med næsten nul værdier. Det angiver dog ikke korrekt andelen af det samlede antal fluer, der er placeret i lugtkvadranten. For at opnå dette målpunkt kan der anvendes et procentindeks (PI):
   
   hvor _N-test er antallet af datapunkter i testkvadranten, og N i_alt er det samlede antal datapunkter i alle fire kvadranter. Denne formel indeholder et målpunkt, der falder mellem 0 og 1, med 0,25, der ikke svarer til nogen adfærdsmæssig præference (Figur 1E og 2C, Supplerende kode AttractionIndex.m).
5. Kør 5-10 gentagelser af hver eksperimentel tilstand ved hjælp af en ny gruppe fluer for hver gentagelse. Sammenlign attraktionsindekserne mellem betingelser eller med kontroller ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov ikke-parametrisk test(Figur 1F, kstest2-funktionen i Matlab).

Results

Figur 1: Eksempeldata genereret ved hjælp af en olfaktorisk analyse med fire felter. (A)Skematisk over arenaen med fire felter. (B) Neutrale reaktioner observeres, når alle fire kvadranter kun indeholder tør luftperfusion. (C) Attraction svar på en 6,25% fortynding af æble cider eddike perfunderes fra venstre øvre kvadrant. (D) Frastødning adfærd udløst a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<strong>Air delivery system</strong>			<strong>(Quantity needed)</strong>
<em><strong>Tubing and connectors</strong></em>
Thermoplastic NPT(F) Manifolds	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Tubing (ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Tubing (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Barbed tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 pack
Push-to-connect tube fittings	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2 pack (10)
Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Hex head plug	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
<em><strong>Air pressure regulator, air filter and flowmeters</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Labatory gas drying unit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Model: L68-NP-303; stock #26840	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Multitube frames for 150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm flowtubes	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Valve Cartridge	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Precision Air regulator	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Soleniod valves	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Solenoid valve controller	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	18-Jan	1
Electronic flow meter	Honeywell	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a	National Instruments	NI USB-6009	1
Power supply	Extech Instruments	382200	1
Odor chambers
Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114)
Glass odor chamber, 0.25 oz	Sunburst Bottle	LB4B	At least 5 are required per experiment
"In" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
"Out" valve for odor chamber	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently
O ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 pack (100)
<em><strong>Fly arena, camera and behavior boxes</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Behavior and camera box material	Interstate plastics, CA, USA	ABS black extruded (<a href="https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php" target="_blank">https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php</a>)	1803 sq inch
Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	2
Dual action thermoelectric controller	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR LED array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED arrays and one power supply
Air conditioner Unit	Melcor Store	MAA280T-12	1
<em><strong>Imaging system</strong></em>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	PEC21211 KP	1
CCXC-12P05N Interconnect Cable	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Camera Adapter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SODC700	1
B+W 40,5 093 IR filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer	Amazon		1
IR Videocamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB video converter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (fly tracking software)	Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture software	The Imagingsource, NC, USA	(<a href="https://www.theimagingsource.com/" target="_blank">http://www.theimagingsource.com/</a>)
<strong>Miscellaneous</strong>			<strong>(Quantity needed)</strong>
Dremel rotary tool	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamond-coated drill bits for glass cutting	Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1