Overview
果蝇有复杂的嗅觉系统，可以区分数百种气味，并利用它们的嗅觉来指导行为决策。该视频描述了四向嗅觉仪测定，这是一种研究苍蝇嗅觉行为反应的方法。特色协议剪辑显示如何处理试飞以及执行检测时的关键步骤是什么。
Protocol
本协议摘自林等人的 《嗅觉行为》，由计算机跟踪 的德罗索菲拉 在四象限嗅觉仪，J.Vis.Exp.（2016 年）。
1. 对诱人和驱虫气味的行为反应
- 打开温度控制器并将其设置为 25 °C。
- 通过将管子插入气味室的出口和行为盒上的推接连接装置，将气味室（控制和测试气味）连接起来。
- 使用气流计检查每个象限中的流速，以确保控制和气味气流等于 100 毫升/分钟。
- 用 70% 乙醇 2-3 次清洁 PTFE 飞行竞技场和玻璃板，使其完全干燥（~3-4 分钟）。
- 用夹子将玻璃板贴在竞技场上。
- 通过其中一个玻璃板的孔将没有 CO2 麻醉的苍蝇转移到竞技场。转移后，在孔上放置一个圆形网格，以防止苍蝇逃跑。
注： CO2 麻醉已被证明影响 嗜血杆菌 行为，不应在行为实验的 24 小时内使用。 - 将带苍蝇的竞技场放入光线密闭的室内，通过将连接到行为箱上推接装置的管子连接到竞技场角落，连接四个控制空气流，关闭房间的门，等待 10-15 分钟，让苍蝇适应新环境。如果可能，请关闭进行实验的房间里的灯，以避免可能偏向实验结果的最小光线泄漏。
- 运行一个5-10分钟的控制实验，其中苍蝇暴露在4个控制气流中。
- 立即分析数据（见下面的数据分析部分），以确保苍蝇在竞技场上均匀分布，吸引力指数接近 0。这一步骤至关重要，因为它验证了竞技场内没有不受控制的偏好或避免来源（例如 从外部泄漏的光线、不均匀的温度分布、不均匀的竞技场、气味污染 等）。如果苍蝇分布不均或它们的运动活性低，丢弃苍蝇，再次清洁竞技场（第1.4步），并使用一批新的苍蝇重复实验。
- 通过打开三向阀或重新插入连接管，将测试气味室连接到设置。
- 运行测试实验5-10分钟，并分析下面第2节（图1）中讨论的数据。记录时间超过 20 分钟可能会导致难以计算处理的数据文件。如果需要更长的实验记录，请快速停止并重新启动跟踪程序。这会导致实验录音之间有大约 10 秒的间隔。
- 丢弃苍蝇。
- 使用 70% 乙醇（步骤 1.4）清洁竞技场和玻璃板，并在光线紧绷的外壳内更换连接管。为了加快实验速度，可以使用新的清洁竞技场，在进行实验运行时清洁肮脏的竞技场。
- 如果需要，用一批新的苍蝇进行另一个实验。如果在同一天运行几个实验，请格外小心，以确保系统中没有从之前的测试运行中留下任何气味。这通常不是气味浓度低或二氧化碳的问题，但对于高度浓缩的刺激，实验运行之间可能需要长达24小时的间隔。此外，如果在控制实验中怀疑臭味污染，流管后的所有管子都可以更换。始终在实验之间保持干燥的空气，以持续冲洗系统。
2. 数据分析
注： 建议的苍蝇跟踪采集软件（详见材料），在采集过程中实时跟踪苍蝇，并以 *.dat 格式保存所有检测到的苍蝇的时间戳和坐标。我们开发了一个定制的 Matlab 程序，将数据转换为马特拉布格式，并分析数据。补充材料中提供了代码示例，但实施详情将取决于用于数据采集的软件。
- 加载原始数据。创建一个跟随竞技场轮廓的空间面膜，并将面膜应用到原始数据中，以删除竞技场外代表噪音的所有数据点（图 2A、辅助代码面膜空间过滤.m、分数.m、绘制圆形面具.m）。
- 删除所有以低于 0.163 厘米/s 的速度移动超过 3s 的数据点，因为此数据可能是噪音或由非移动苍蝇生成（图2B，补充代码临时过滤.m）。
- 通过同时绘制出所有数据点或作为单个轨迹（图 1，补充代码单个轨道查看器.m）来可视化剩余的数据点。
注：气味边界在四个场位的位置可能取决于许多因素，例如每个气味的特性和所使用的气流速率。例如，高挥发性气味可能比挥发性较小的气味更充分地填充气味象限。因此，每个气味可能表现出略有不同的气味边界。使用光电成像探测器测量气味边界可能会有问题，因为它使用真空从特定点采样空气，因此会破坏该点的气味浓度。尽管如此，气味边界可以根据飞行行为数据快速估计。例如，在图 1C和1D中可以清楚地观察到基于累积的飞行轨迹的气味边界，以响应不同的气味。 - 计算吸引力指数，以确定控制实验是否生成任何偏好响应，以及访问对异味（或光遗传）刺激的反应。要计算吸引索引 （AI），请使用控制或测试记录的最后 5 分钟。要获得介于 +1（绝对吸引力）和 -1（绝对排斥）之间的吸引力测量，使用以下公式计算 AI：
其中 N测试是测试象限中的数据点数，N控是三个控制象限中的数据点的平均数。此衡量标准是直观的，因为几乎为零值不会表示任何偏好。但是，它没有正确指示位于气味象限中的苍蝇总数的比例。要获得此衡量标准，可以使用百分比指数 （PI）：
其中 N测试是测试象限中的数据点数，而 N总数是所有四个象限中的数据点总数。此公式提供了介于 0 和 1 之间的度量，0.25 对应于无行为偏好（图 1E和2C，补充代码吸引力.m）。 - 运行每个实验条件的 5-10 重复，每次重复使用一组新的苍蝇。使用科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫非参数测试（图1F，kstest2功能在马特拉布）比较条件之间的吸引力指数或对照对控制。
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Representative Results
图1：使用四字段嗅觉测定生成的示例数据。 （A） 四场竞技场的示意图。（B） 当所有四个象限都只含有干空气灌注时，观察到中性反应。（C） 吸引对从左上象限中浸出的苹果醋稀释 6.25% 的反应。（D） 由10%乙基丙酸酯触发的排斥行为。在图 2B-2D 中，绘制了从获得的数据中单个轨迹。颜色梯度用于表示录制的时间过程，蓝色和红色分别是录制的开始和结束。（E） 吸引力指数 （AI） 和百分比指数 （PI） 的比较。（F） 平均AI的3-6个实验无异味（控制），苹果醋（ACV）和10%乙基丙酸酯（EP）。错误条表示 Sem. 统计差异由科尔莫戈罗夫 - 斯米尔诺夫测试评估。 请单击此处查看此图的更大版本。
图2：数据分析步骤生成的示例数据。 （A） 由 MaskS 空间文件执行的数据空间过滤.m以删除竞技场外的数据点。红色圆圈显示用于定义竞技场边界的圆的初始位置。黑圆是最终的位置，通过将圆轮廓与数据（四个字段内的灰色阴影区域）相配而获得。红点和黑箭头表示在此筛选步骤后将从数据集中删除的数据点。（B） 数据的临时过滤，由临时过滤执行.m。此过滤步骤可删除移动非常缓慢或根本不移动的数据点，因为它们很可能由不移动的苍蝇或来自竞技场的污垢/反射生成。被破折号的红色框包围的红点表示具有相同坐标的约 6，000 个数据点的位置，这些坐标将通过此过滤步骤删除。（C） 吸引力指数 （AI） 和百分比指数 （PI），在吸引力指数实验的最后 5 分钟内在 10 秒的垃圾箱中计算.m。这些索引的临时配置文件包含有关行为反应动态的信息，可用于行为的详细分析。 请单击此处查看此图的更大版本。
补充代码文件。请单击此处查看此文件（右键单击下载）。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 18-Jan | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture software | The Imagingsource, NC, USA | (http://www.theimagingsource.com/) | |
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
