Overview
I moscerini della frutta hanno un complesso sistema olfattivo, possono discriminare centinaia di odori e usare il loro senso dell'olfatto per dirigere le decisioni comportamentali. Questo video descrive il saggio olfattometro a quattro modi, un metodo per studiare le risposte comportamentali olfattive nelle mosche. La clip del protocollo in primo piano mostra come gestire le mosche di prova e quali sono i passaggi critici durante l'esecuzione del test.
Protocol
Questo protocollo è un estratto da Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).
1. Risposte comportamentali agli odoranti attraenti e repellenti
- Accendere il regolatore di temperatura e impostarlo su 25 °C.
- Collegare le camere odoranti (odori di controllo e prova) inserendo il tubo all'uscita della camera di odoro e al raccordo push-to-connect sulla scatola di comportamento.
- Controllare la portata in ogni quadrante utilizzando il misuratore di flusso d'aria per assicurarsi che i flussi d'aria di controllo e odoro siano uguali a 100 ml/min.
- Pulire l'arena di volo PTFE e le piastre di vetro con il 70% di etanolo 2-3 volte e consentire loro di asciugare completamente all'aria (~ 3-4 min).
- Apporre le lastre di vetro nell'arena con morsetti.
- Trasferire le mosche senzaanestesia di CO 2 nell'arena attraverso il foro in una delle piastre di vetro. Dopo il trasferimento, posizionare una rete circolare sul foro per evitare che le mosche scappino.
NOTA: L'anestesia da CO 2 ha dimostrato di influenzare il comportamento della Drosophila e non deve essere utilizzata entro 24 ore da un esperimento comportamentale. - Posizionare l'arena con le mosche nella camera leggera, collegare i quattro flussi d'aria di controllo collegando i tubi attaccati al raccordo push-to-connect sulla scatola di comportamento agli angoli dell'arena, chiudere la porta della camera e attendere 10-15 minuti per lasciare che le mosche si acclimatino al nuovo ambiente. Se possibile, spegnere le luci nella stanza in cui vengono eseguiti gli esperimenti, per evitare possibili perdite minime di luce che potrebbero polarizzare il risultato sperimentale.
- Esegui un esperimento di controllo di 5-10 minuti, in cui le mosche sono esposte a 4 flussi d'aria di controllo.
- Analizza immediatamente i dati (vedi la sezione analisi dei dati qui sotto) per assicurarti che le mosche siano distribuite uniformemente nell'arena e che l'indice di attrazione sia vicino a 0. Questo passaggio è essenziale, in quanto verifica che non vi siano fonti incontrollate di preferenzao di elusione all'interno dell'arena (ad esempio perdita di luce dall'esterno, distribuzione irregolare della temperatura, arena irregolare, contaminazione da odori, ecc.). Se le mosche sono distribuite in modo ineguale o la loro attività locomotoria è bassa, scartare le mosche, pulire di nuovo l'arena (Passaggio 1.4) e utilizzare un nuovo lotto di mosche per ripetere l'esperimento.
- Collegare la camera di odoro di prova alla configurazione accendendo le valvole a 3 vie o ricondottando i tubi del connettore.
- Eseguire l'esperimento di prova per 5-10 minuti e analizzare i dati come discusso nella sezione 2 riportata di seguito (Figura 1). Le registrazioni più lunghe di 20 minuti possono comportare file di dati che possono essere difficili da elaborare computazalmente. Se si desiderano registrazioni sperimentali più lunghe, arrestare e riascincere rapidamente il programma di tracciamento. Ciò si traduce in un divario di ~ 10 secondi tra le registrazioni sperimentali.
- Scartare le mosche.
- Pulire l'arena e le piastre di vetro con il 70% di etanolo (Step 1.4) e sostituire i tubi del connettore all'interno dell'involucro a tenuta di luce. Per accelerare gli esperimenti, è possibile utilizzare una nuova arena pulita e pulire l'arena sporca durante l'esecuzione di corse sperimentali.
- Esegui un altro esperimento con un nuovo lotto di mosche, se necessario. Se più esperimenti vengono eseguiti lo stesso giorno, prestare estrema attenzione a garantire che nel sistema non sia lasciato alcun odore da una precedente esecuzione di test. Questo normalmente non è un problema con basse concentrazioni di odori o con CO2, ma per stimoli altamente concentrati può essere necessario un divario di 24 ore tra le corse sperimentali. Inoltre, tutti i tubi dopo i tubi di flusso possono essere sostituiti se si sospetta una contaminazione da odoro durante gli esperimenti di controllo. Lasciare sempre l'aria secca tra gli esperimenti per sciacquare continuamente il sistema.
2. Analisi dei dati
NOTA: Il software di acquisizione fly tracking suggerito (dettagliato in Materials), tiene traccia delle mosche in tempo reale durante l'acquisizione e salva il timestamp e le coordinate di tutte le mosche rilevate in formato *.dat. Abbiamo sviluppato una routine Matlab su misura per convertire i dati in un formato Matlab e per analizzare i dati. Esempi di codice sono forniti in Materiali supplementari, ma i dettagli di implementazione dipenderanno dal software utilizzato per l'acquisizione dei dati.
- Caricare i dati non elaborati. Create una maschera spaziale che segua i contorni dell'arena e applicate la maschera ai dati non elaborati per rimuovere tutti i punti dati che non rientrano nell'arena in quanto rappresentano il rumore (Figura 2A, Supplementary Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
- Rimuovere tutti i punti dati che si spostano a una velocità inferiore a 0,163 cm/s per più di 3s, poiché è probabile che questi dati siano rumori o generati da mosche non in movimento (Figura 2B, Supplementary Code TemporalFiltering.m).
- Visualizzare i punti dati rimanenti tracciandoli tutti contemporaneamente o come singole traiettorie (Figura 1, Codice aggiuntivo SingleTrajectoryViewer.m).
NOTA: L'ubicazione dei confini degli odori nei quattro campi dipende probabilmente da una serie di fattori, come le caratteristiche di ciascun odore e i tassi di flusso d'aria utilizzati. Ad esempio, gli odori altamente volatili probabilmente riempiranno il quadrante degli odori in modo più completo rispetto agli odori meno volatili. Pertanto, è probabile che ogni odore possa mostrare confini di odore leggermente diversi. L'uso di un rivelatore di fotoionizzazione per misurare i confini degli odori può essere problematico in quanto utilizza un vuoto per campionare l'aria da un particolare punto, e quindi interrompe la concentrazione di odori in quel punto. Tuttavia, i limiti degli odori possono essere rapidamente stimati in base ai dati comportamentali della mosca. Ad esempio, un limite di odore basato su binari di volo cumulati in risposta a diversi odori può essere chiaramente osservato nella figura 1C e 1D. - Calcola un indice di attrazione per determinare se gli esperimenti di controllo non generano risposta di preferenza e anche per accedere alla risposta a uno stimolo odorante (o optogenetico). Per calcolare un indice di attrazione (AI), utilizzare gli ultimi 5 minuti di un controllo o di una registrazione di prova. Per ottenere una misura di attrazione che si trova tra +1 (attrazione assoluta) e -1 (repulsione assoluta), per calcolare l'IA viene utilizzata la seguente formula:
dove Ntest è il numero di punti dati nel quadrante di prova, Ncontrollo è il numero medio di punti dati nei tre quadranti di controllo. Questa misura è intuitiva in quanto nessuna preferenza sarebbe indicata da valori vicini allo zero. Tuttavia, non indica correttamente la proporzione del numero totale di mosche che si trovano nel quadrante dell'odoro. Per ottenere questa misura, è possibile utilizzare un indice percentuale (PI):
dove Ntest è il numero di punti dati nel quadrante di prova, e Ntotale è il numero totale di punti dati in tutti e quattro i quadranti. Questa formula fornisce una misura compresa tra 0 e 1, con 0,25 corrispondente a nessuna preferenza comportamentale (Figura 1E e 2C, Supplementary Code AttractionIndex.m). - Esegui 5-10 ripetizioni di ogni condizione sperimentale, usando un nuovo gruppo di mosche per ogni ripetizione. Confrontare gli indici di attrazione tra le condizioni o con i controlli utilizzando il test non parametrico Kolmogorov-Smirnov (Figura 1F, funzione kstest2 in Matlab).
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Representative Results
Figura 1: Dati di esempio generati utilizzando un saggio olfattivo a quattro campi. (A) Schema dell'arena a quattro campi. (B) Le risposte neutre si osservano quando tutti e quattro i quadranti contengono solo perfusione di aria secca. (C) Risposte di attrazione ad una diluizione del 6,25% dell'aceto di sidro di mele perfuso dal quadrante superiore sinistro. (D) Comportamenti di repulsione innescati dal 10% di propionato di etile. Nella figura 2B-2D viene tracciata una singola traiettoria dai dati acquisiti. Una sfumatura di colore viene utilizzata per indicare il corso del tempo di registrazione, con i colori blu e rosso che sono rispettivamente l'inizio e la fine delle registrazioni. (E) Confronto tra l'indice di attrazione (AI) e l'indice percentuale (PI). (F) IA medie di 3- 6 esperimenti senza odore (controllo), aceto di sidro di mele (ACV) e 10% propionato di etile (EP). Le barre di errore indicano SEM. La differenza statistica è stata valutata dal test di Kolmogorov-Smirnov. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Dati di esempio generati dai passaggi di analisi dei dati. (A) Filtraggio spaziale dei dati, eseguito da MaskSpatialFiltering.m per rimuovere i punti dati che non rientrano nell'arena. I cerchi rossi mostrano le posizioni iniziali dei cerchi utilizzati per definire i bordi dell'arena. I cerchi neri sono le posizioni finali, acquisite adattando i contorni del cerchio ai dati (area ombreggiata grigia all'interno del campo a quattro). I punti rossi e le punte delle frecce nere indicano i punti dati che verranno rimossi dal set di dati dopo questo passaggio di filtro. (B) Filtraggio temporale dei dati, eseguito da TemporalFiltering.m. Questo passaggio di filtraggio rimuove i punti dati che si muovono molto lentamente o per niente, poiché è probabile che vengano generati da mosche non in movimento o da sporcizia / riflessi dall'arena. Un punto rosso circondato da una casella rossa tratteggiata indica posizioni di ~6.000 punti dati con coordinate identiche che verranno rimosse da questo passaggio di filtro. (C) Indice di attrazione (AI) e Indice percentuale (PI), calcolati in contenitori di 10 secondi negli ultimi 5 minuti di un esperimento da AttractionIndex.m. I profili temporali di questi indici contengono informazioni sulla dinamica delle risposte comportamentali e possono essere utilizzati per un'analisi dettagliata dei comportamenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File di codice supplementare. Clicca qui per visualizzare questo file (fai clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 18-Jan | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture software | The Imagingsource, NC, USA | (http://www.theimagingsource.com/) | |
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
