Light Spot Assay: Une méthode pour étudier le comportement phototaxique Drosophila

Overview

Les larves de drosophiles sont sensibles à la lumière et réagissent aux changements de la lumière environnante. Cette vidéo décrit un test qui teste leur capacité à éviter la lumière, appelée l’analyse des taches lumineuses. Le protocole en vedette montre comment configurer l’analyse avec une LED de lumière bleue et montre comment enregistrer le comportement de l’animal en réponse à la rencontre de lumière.

Protocol

Ce texte du protocole est un extrait de Sun et coll., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. Mise en place du système d’imagerie

1. Pincez une caméra Web haute résolution avec un clip en fer, à environ 10 cm au-dessus du point lumineux sur le bureau (Figure 1).
2. Ajustez l’orientation de l’objectif de la caméra vers le bureau. Connectez la caméra à un ordinateur via une interface USB.
3. Placez une plaque d’agar sur le bureau juste sous la caméra.
4. Ouvrez le logiciel « Amcap9.22 » sur l’ordinateur avec Windows 7, et le point lumineux sera automatiquement affiché dans la fenêtre d’AMcap. Déplacez la caméra légèrement à gauche ou à droite pour vous assurer que le point lumineux se trouve près du centre de la fenêtre. Assurez-vous que la caméra ne bloque pas le chemin lumineux. Le point lumineux doit être complet et rond.
   REMARQUE: Le logiciel peut être trouvé à http://amcap.en.softonic.com/.
5. Fixez un filtre de 850 nm ± 3 nm band-pass avec un clip à 5-7 mm juste en dessous de la caméra.
   REMARQUE: Le diamètre du filtre est d’environ 2,5 cm, et l’objectif de la caméra est de moins de 1 cm de diamètre, de sorte que le filtre peut couvrir le champ visuel de la caméra. Avec le filtre sous la caméra, le point lumineux ne doit pas être vu dans la fenêtre d’AMcap.
6. Placez trois LED génératrices de lumière infrarouge (longueur d’onde centrale = 850 nm) uniformément autour de la plaque d’agar. Chaque LED doit être à environ 5 cm du bord de la plaque d’agar, et la face de la lentille de la LED doit être à un angle vers le bas de 70° vers la plaque d’agar. Connectez les LED à la puissance grâce au convertisseur AC-to-DC.
   REMARQUE: Il est préférable de fixer les positions et les angles des LED de lumière infrarouge afin d’assurer la cohérence de la luminosité du champ dans divers essais expérimentaux et de faciliter le traitement vidéo ultérieur.
7. Placez une planche noire entre l’ordinateur et l’appareil. Réglez la luminosité de l’écran de l’ordinateur pour empêcher la lumière de l’écran de l’ordinateur d’affecter l’expérience.
   REMARQUE: Gardez l’environnement sombre lorsque vous mesurez la longueur d’onde ou l’intensité de la lumière.

2. Réglage des paramètres de l’imagerie

1. Au menu du logiciel AMcap, choisissez Options | Dispositif vidéo | Capturez le format, et réglez la taille des pixels de la vidéo capturée à 800 x 600 et le taux d’image à 60 fps.
2. Retirez le filtre sous la caméra, placez une règle sous la caméra et ajustez la mise au point de la caméra pour rendre la ligne d’échelle claire et parallèle à la largeur du champ de vision vidéo.
3. Cliquez sur Capture | Mettre en place | Capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement, cliquez sur Démarrer l’enregistrement,enregistrer la distance réelle correspondant à 600 pixels, et calculer le rapport de chaque pixel à la distance réelle.

3. Enregistrement vidéo du comportement d’évitement de la lumière

1. Maintenir une température de 25.5 °C à travers toutes les expériences. Contrôlez la température ambiante avec un climatiseur si nécessaire. Gardez l’humidité constamment à 60% avec un humidificateur.
2. Prenez une courte vidéo de la position du point lumineux nommé « lightarea1 ». Ensuite, déplacez le filtre de 850 nm ± 3 nm vers l’arrière pour couvrir l’objectif de la caméra.
   REMARQUE: Lors de l’enregistrement du comportement larvaire, l’objectif de la caméra est couvert par le filtre de 850 nm ± 3 nm de sorte que le point lumineux n’est pas affiché dans la vidéo. Le point lumineux peut être reconstruit en vidéos avec des larves plus tard avec Matlab. Ne modifiez pas la position de la caméra et évitez de modifier le rapport de chaque pixel à la distance réelle mesurée à l’étape 2.3.
3. Allumez une lumière (c.-à-d. une lumière de pièce) loin du dispositif expérimental. Baissez la lumière aussi bas que possible, tant que les larves peuvent être clairement vues avec les yeux. Retirer les larves du milieu de culture à l’aide d’une cuillère, cueillir délicatement une larve de troisième stade et la laver à l’eau distillée. Veillez à laver la larve une à la fois pour éviter les interférences de la faim. Une seule expérience nécessite au moins 20 larves.
4. Transférer la larve au centre de la plaque d’agar placée sous la caméra pendant l’étape 1.3. Retirez doucement l’excès d’eau de la larve à l’aide d’une brosse ou utilisez du papier buvard pour enlever l’eau de la larve afin d’éviter la réflexion de la lumière sous la lentille. Éteignez la lumière ambiante et laissez la larve s’acclimater pendant 2 min dans l’environnement sombre.
5. Allumez la lumière LED pour générer de la lumière infrarouge, et brossez doucement la larve au centre de la plaque. Lorsque la larve commence à ramper droit, faites pivoter la plaque pour faire la tête de larve vers le point lumineux. Assurez-vous qu’il rampe directement dès le début, sinon il peut ne pas obtenir l’accès à la tache lumineuse.
6. Cliquez sur Capture | Mettre en place | Capture vidéo pour sélectionner le chemin d’enregistrement, puis cliquez sur Démarrer l’enregistrement pour enregistrer. Laissez la larve ramper vers le point lumineux, entrez dans le point lumineux, puis laissez le point lumineux jusqu’à ce qu’il soit presque hors du champ de vision. Cliquez sur Arrêter l’enregistrement. Si la larve se détourne du point lumineux avant de s’approcher, cliquez directement sur Arrêter l’enregistrement.
7. Éloignez le filtre de la caméra. Prenez une courte vidéo de la position du point lumineux nommé « lightarea2 » et comparez-la à « lightarea1 » pour vous assurer que la position du point lumineux n’est pas modifiée. Si un changement de position évident est observé, jetez les données.

Representative Results

Figure 1 : Installation expérimentale. (A) Représentation schématique de la mise en place pour l’essai de phototaxis rapide larvaire à base de taches lumineuses. Les lignes bleues représentent les chemins de la lumière visible utilisés comme stimulation visuelle, et les lignes rouges représentent les chemins de la lumière infrarouge. Les flèches indiquent la direction de la lumière. Le filtre band-pass de 850 nm permet à la lumière infrarouge de passer, mais il bloque la lumière visible. (B) Une image de la mise en place pour l’analyse des taches lumineuses. Il convient de noter que l’image a été prise dans des conditions de lumière pour une meilleure visualisation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidth: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920x1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120° Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%