드로소필라 계란 누워 선호 분석 : 파리에서 의사 결정을 테스트하는 방법

Overview

드로소필라 여성은 기판과 계란 누워에 매력적인 선택 부위 중에서 선택합니다. 이 비디오는 계란 누워 선호 분석이라고 불리는 의사 결정을 테스트하는 행동 분석법을 설명합니다. 이 특색 클립은 맞춤형 설정으로 절차를 시연하여 연구원이 동시에 많은 여성의 행동을 테스트할 뿐만 아니라 비디오 녹화 및 광유전학 적 설정과도 호환됩니다.

Protocol

이 프로토콜은 Gou 외에서발췌입니다 ., 개인 Drosophila 멜라노가스터의계란 누워 환경 설정을 검사하는 높은 처리량 분석,J. Vis. Exp. (2016). 

1. 챔버 건설, 어셈블리, 분석 설정

1. 기계 가게가 아크릴 계란 누워 챔버를 구축(그림 1A-D)를가지고있다. 다른 조각의 엔지니어링 그림은 보충 도 1-3에표시되었다. 고해상도 사진은 여기에서도 찾을 수 있습니다(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. 도 1C에도시된 바와 같이 챔버의 적재(상단) 조각에 플라스틱 시트를 삽입합니다. 이것은 개별 계란 누워 경기장에 날아를로드하는 동안 바닥 표면 역할을합니다.
3. CO₂ 패드에서 여성을 마취하고 각 계란 누워 경기장에 개별적으로 적재합니다. CO_2에서 파리가 회복되고 새로운 환경에 익숙해질 수 있도록 ~ 30분 이내하십시오.
4. 아가로즈 기판을 준비한다.
   1. 편의를 위해 55°C의 수조에 녹인 1% 아가로즈의 미리 만들어진 병을 보관하십시오.
   2. 원하는 양의 스톡 자당 용액(2M)을 50ml 원추형 튜브에 넣고 적절한 양의 아가로즈로 혼합합니다. 예를 들어, 150m 자당 기판을 준비하려면, 튜브에 2M 자당 용액의 750 μl을 배치한 다음 10ml 마크로 아가로즈로 튜브를 채웁니다.
   3. 일반 기판을 동일한 방식으로 준비하지만 자당 용액 대신 증류수를 추가합니다.
      참고: 이 프로토콜에서 아가로즈의 최종 농도는 1% 미만입니다. 우리의 경험에서, 아가로즈의 정확한 농도는 ~0.9 - 1.1% 이내로 제어되고 두 기판이 동일한 아가로즈 농도인 한 중요하지 않습니다.
5. 도 1D에서볼 수 있듯이 각 트로프에 아가로즈 기판의 챔버 및 파이펫 1,000 μl의 기판(bottom) 조각을 가져 가라.
6. 아가로즈가 ~30분 동안 굳어지도록 허용합니다.
7. 아가로즈 기판과 파리가 준비되면 계란 누워 챔버의 세 조각을 모두 조립한 다음 플라스틱 시트를 꺼낸다.
8. 챔버를 플라이 인큐베이터에 배치합니다.
   참고: 달걀 누워 실험의 길이는 실험 요구에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 일반적으로 실험 O / N (14 - 16 시간)을 실행합니다. 또한, 계란 누워 환경 설정에 circadian 타이밍의 중요 한 영향을 관찰 했다 관찰 되었다.
9. 챔버에 CO_2를 주입하여 여성을 마취. 챔버를 분해하고 마취 된 파리를 플라이 모르그로 버리십시오(즉,빈 커피는 옥수수 기름으로 채워져 있습니다). 기록 보관을 위한 결과 사진을 찍습니다(그림 2참조).
10. 계란 수를 수동으로 계산하고 분석을 위한 기본 설정 지수를 계산합니다. 기본 설정 인덱스를 계산 (N_a - N b)/(N_a + N_b)여기서 N_a 및 N_b는 사이트에 계란의 수를 나타냅니다.

Representative Results

그림 1: 달걀 누워 챔버와 계란 누워 프로토콜. (A)완전히 조립 된 계란 - 누워 챔버. (B)분해 된 조각. a : 로딩 조각 (상단), b : 디바이더 조각 (가운데), c : 기판 (아래) 조각. 이 조각의 엔지니어링 도면은 보충 도 1-3에표시됩니다. (C)챔버의 적재 조각. a': 슬라이딩 도어, a": 레일. 플라스틱 시트는 적재된 파리를 제자리에 유지하기 위해 바닥역할을 하기 위해 적재조각에 삽입됩니다. 우리는 일반적으로 플라스틱 시트 (빨간색 화살표)의 가장자리에 색상 테이프를 넣습니다. (D)기판(아래)과 챔버의 디바이더(가운데) 조각. 아가로즈는 달걀 누워 기판 (화살표)역할을 개별 쓰루에 증착된다. 쿼드리탈은 한 번의 비행을 위해 달걀 누워 있는 경기장을 간략하게 설명합니다. (E)모동 유리병에 모은 암컷/남성의 0일째. (F)효모 바이알에서 수집된 암컷/남성의 4일째 5일. 유충과 성인 암컷은 효모의 대부분을 먹었으며 음식표면은 애벌레에 의해 점령되고 있습니다. 유충으로 기어 다니는 젖은 표면 음식은 암컷이 유리병에 더 많은 알을 낳는 것을 방지합니다. (G)계란 누워 행동 실험을 설정하기위한 프로토콜을 묘사 하는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 수크로오스와 일반 기판 사이에서 선택하는 파리에 대한 대표적인 계란 누워 결과. (A)자당(150mMMMM)과 일반 기판 사이에서 선택을 받았을 때 야생형 파리의 알 누워 결과의 측면보기. 화이트 박스는 하나의 비행을 위해 하나의 계란 누워 경기장을 윤곽. (B)계란 누워 결과의 최고 보기. 화이트 박스는 하나의 비행을 위해 하나의 계란 누워 경기장을 윤곽. (C)자당 함유 기판과 일반 기판 중에서 선택하도록 요청받은 야생형의 기본설정지수(PI)가 날아간다. 각 여성에 대한 PI는 다음과 같이 계산됩니다 : (자당 기판에 계란의 수 - 일반 기판에 계란의 수)/ 계란의 총 수. 오류 표시줄은 SEM을 나타냅니다.

보충 도1: 분할및 챔버의 기판 조각에 대한 엔지니어링 도면. (A-A") 챔버의 기판 조각의 다른 보기. (B-B') 챔버의 중간 분배기 조각의 다른 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 챔버의 로딩 조각에 대 한 엔지니어링 도면. (A-A') 챔버의 로딩 조각의 상층의 다른 보기. (B-B') 챔버의 로딩 조각의 하단 레이어의 다른 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 슬라이딩 도어및 챔버의 레일에 대한 엔지니어링 도면. (A)레일이 챔버의 상단 부분에 고정되어 있습니다. (B)챔버의 슬라이딩 도어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC