Drosophila Egg-Laying Preference Assay: een methode om besluitvorming bij vliegen te testen

Overview

Drosophila-vrouwtjes kiezen tussen substraten en selecteren locaties die aantrekkelijk zijn voor het leggen van eieren. Deze video beschrijft een gedragstest die hun besluitvorming test, de zogenaamde eierleggingsvoorkeurstest. De aanbevolen clip demonstreert de procedure met een op maat gemaakte opstelling, waarmee onderzoekers niet alleen het gedrag van veel vrouwen tegelijkertijd kunnen testen, maar ook compatibel zijn met video-opname en optogenetische opstellingen.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Kamerbouw, Assemblage, Assay Setup

1. Laat een machinewerkplaats acryl eierlegkamers bouwen(figuur 1A-D). De technische tekening van verschillende stukken werd weergegeven in aanvullende figuur 1-3. Hoge resolutie foto's zijn ook hier te vinden(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Plaats plastic platen in het laadstuk (boven) van de kamer, zoals aangegeven in figuur 1C. Dit dient als het onderste oppervlak tijdens het laden van vliegen in individuele eierleggende arena's.
3. Verdoof vrouwtjes op een CO_2-pad en laad ze individueel in elke arena voor het leggen van eieren. Laat ~30 min voor vliegen om te herstellen van de CO₂ en om te wennen aan de nieuwe omgeving.
4. Bereid de agarose substraten voor.
   1. Bewaar voor het gemak een vooraf gemaakte fles gesmolten 1% agarose in een waterbad van 55 °C.
   2. Voeg de gewenste hoeveelheid bouillonsucroseoplossing (2 M) toe aan een conische buis van 50 ml en meng deze met de juiste hoeveelheid agarose. Om bijvoorbeeld het 150 mM sucrosesubstraat voor te bereiden, plaatst u 750 μl 2 M sucrose-oplossing in de buis en vult u de buis vervolgens met agarose tot de 10 ml-markering.
   3. Bereid het gewone substraat op dezelfde manier, maar voeg gedestilleerd water toe in plaats van sacharose-oplossing.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van agarose in dit protocol is iets minder dan 1%. Onze ervaring is dat de exacte concentratie van agarose er niet toe doet zolang het wordt gecontroleerd om binnen ~ 0,9 - 1,1% te zijn en dat de twee substraten van dezelfde agaroseconcentratie zijn.
5. Neem het substraat (onderste) stuk van de kamer en pipet 1.000 μl agarosesubstraat in elke trog zoals te zien in figuur 1D.
6. Laat agarose ~30 min stollen.
7. Zodra de agarose substraten en vliegen klaar zijn, monteert u alle drie de stukken van de eierlegkamer en haalt u vervolgens de plastic vellen eruit.
8. Plaats de kamers in vliegincubatoren.
   OPMERKING: De duur van het leggen van eieren kan variëren, afhankelijk van de experimentele behoeften. We voeren meestal het experiment O/N uit (14 - 16 uur). Ook werd geen significante impact van circadiane timing op de voorkeuren voor het leggen van eieren waargenomen.
9. Verdoof vrouwtjes door CO₂ in de kamer te injecteren. Demonteer de kamer, gooi de verdoofde vliegen weg in het mortuarium van de vlieg(d.w.z.een lege koffiekan gevuld met wat maïsolie). Maak foto's van de resultaten voor de registratie (zie figuur 2).
10. Tel het aantal eieren handmatig en bereken voorkeursindexen voor analyse. Bereken de voorkeursindex als (N_a - N_b)/(N_a + N_b) waarbij N_a en N_b respectievelijk het aantal eieren op locatie a versus plaats b vertegenwoordigen.

Representative Results

Figuur 1: Legkamers voor eieren en protocol voor het leggen van eieren. (A) Volledig gemonteerde eierlegkamer. (B) Gedemonteerde stukken. a: het laadstuk (boven), b: het scheidingsstuk (midden), c: het substraat (onderste) stuk. Technische tekeningen van deze stukken zijn weergegeven in aanvullende figuur 1-3. (C) Het laadstuk van de kamer. a': schuifdeuren, a": rails. De plastic platen worden in het laadstuk gestoken om als vloer te dienen om de geladen vliegen op hun plaats te houden. We leggen meestal kleurtapes op de rand van de plastic vellen (rode pijl). (D) De substraat (bodem) en de scheidingswand (middelste) stukken van de kamer. Agarose wordt afgezet in individuele troggen om te dienen als eierleggende substraten (pijlen). Vierhoekige contouren van de eierlegarena voor een enkele vlieg. (E) Dag 0 van verzamelde vrouwtjes/mannetjes in een gegiste flacon. (F) Dag 4 - 5 van de verzamelde vrouwtjes/mannetjes in een gegiste flacon. Merk op dat larven en volwassen vrouwtjes het grootste deel van de gist hebben gegeten en dat het oppervlak van het voedsel is bezet door larven. Het natte oppervlaktevoedsel dat met larven kruipt, voorkomt dat vrouwtjes meer eieren in de flacon leggen. (G) Schematisch met het protocol voor het opzetten van experimenten met het leggen van eieren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Representatieve eilegresultaten voor vliegen kiezen tussen sucrose en gewone substraten. (A) Zijaanzicht van de resultaten van het leggen van eieren van wilde vliegen wanneer zij de keuze kregen tussen sacharose (150 mM) en gewone substraten. Witte doos schetst een eierleggen arena voor een enkele vlieg. (B) Bovenaanzicht van de resultaten van het leggen van eieren. Witte doos schetst een eierleggen arena voor een enkele vlieg. (C) Voorkeursindex (PI) van wilde vliegen wanneer gevraagd wordt te kiezen tussen een sacharosehoudend substraat en een gewoon substraat. PI voor elk vrouwtje wordt als volgt berekend: (aantal eieren op sacharosesubstraat - aantal eieren op de gewone substraten)/totaal aantal eieren. Foutbalk geeft SEM aan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Technische tekeningen voor de scheidingswand en het substraatstuk van de kamer. (A-A") Verschillende weergaven van het substraatstuk van de kamer. (B-B') Verschillende meningen van het middenverdelerstuk van de kamer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 2: Technische tekeningen voor het laadstuk van de kamer. (A-A') Verschillende weergaven van de bovenste laag van het laadstuk van de kamer. (B-B') Verschillende weergaven van de onderste laag van het laadstuk van de kamer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende figuur 3: Technische tekening voor de schuifdeur en de rail op de kamer. (A) De rail bevestigd op het bovenste stuk van de kamer. (B) De schuifdeur voor de kamer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC