Drosophila (olika betydelser) Äggläggningspreferensanalys: En metod för att testa beslutsfattande i flugor

Overview

Drosophila honor väljer mellan substrat och utvalda platser som är attraktiva för äggläggning. Den här videon beskriver en beteendemässig analys som testar deras beslutsfattande, kallad äggläggningspreferensanalysen. Det presenterade klippet demonstrerar proceduren med en specialbyggd installation, vilket gör det möjligt för forskare att inte bara testa beteendet hos många kvinnor samtidigt utan är också kompatibelt med videoinspelning och optogenetiska inställningar.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Kammarens konstruktion, montering, analysinställningar

1. Ha en maskinverkstad som bygger akryläggläggningskammare(figur 1A-D). Den tekniska ritningen av olika delar visades i kompletterande figur 1-3. Högupplösta bilder finns också här (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. För in plastplåtar i kammarens (övre) del enligt figur 1C. Detta fungerar som bottenytan medan du laddar flugor i enskilda äggläggningsarenor.
3. Söv kvinnor på en CO_2-dyna och ladda dem individuellt i varje äggläggningsarena. Låt ~30 min för flugor återhämta sig från CO₂ och bli acklimatiserad till den nya miljön.
4. Förbered agarosasubstraten.
   1. För bekvämlighet, håll en förgjord flaska smält 1% agarose i ett 55 °C vattenbad.
   2. Tillsätt önskad mängd sackaroslösning (2 M) i ett 50 ml koniskt rör och blanda det med lämplig mängd agarosa. För att till exempel förbereda 150 mM sackarossubstrat, placera 750 μl 2 M sackaroslösning i röret och fyll sedan röret med agarosa till 10 ml-märket.
   3. Förbered det vanliga substratet på samma sätt men tillsätt destillerat vatten istället för sackaroslösning.
      OBS: Den slutliga koncentrationen av agarose i detta protokoll är något mindre än 1%. Enligt vår erfarenhet spelar den exakta koncentrationen av agarose ingen roll så länge den kontrolleras för att vara inom ~ 0,9 - 1,1% och att de två substraten är av samma agarosakoncentration.
5. Ta underlaget (botten) i kammaren och pipetten 1 000 μl agarosasubstrat i varje tråg enligt figur 1D.
6. Låt agarose stelna i ~30 min.
7. När agarosubstraten och flugorna är klara monterar du alla tre delarna av äggläggningskammaren och tar sedan ut plastlakan.
8. Placera kamrarna i fluginkubatorer.
   OBS: Längden på äggläggningsexperiment kan variera beroende på experimentella behov. Vi kör vanligtvis experimentet O/N (14 - 16 timmar). Ingen betydande inverkan av dygnsrytm timing på äggläggning preferenser observerades.
9. Bedöva kvinnor genom att injicera CO₂ i kammaren. Demontera kammaren, kasta de bedövade flugorna i flugbårhuset (dvs. entom kaffekanna fylld med lite majsolja). Ta bilder av resultaten för bokföring (se figur 2).
10. Räkna antalet ägg manuellt och beräkna inställningsindex för analys. Beräkna inställningsindex som (N_a - N_b)/(N_a + N_b)där N_a och N_b representerar antalet ägg på plats a respektive plats b.

Representative Results

Figur 1: Äggläggningskammare och äggläggningsprotokoll. A)Fullt monterad äggläggningskammare. (B)Demonterade bitar. a: laststycket (överst), b: avdelarbiten (mitten), c: substratet (botten) biten. Tekniska ritningar av dessa delar visas i kompletterande figur 1-3. C)Kammarens laststycke. a': skjutdörrar, a": skenor. Plastplåtarna sätts in i laststycket för att fungera som ett golv för att hålla de laddade flugorna på plats. Vi sätter vanligtvis färgband på kanten av plastplåtarna (röd pil). (D) Substratet (botten) och avdelarens (mitten) delar av kammaren. Agarose deponeras i enskilda tråg för att fungera som äggläggande substrat (pilar). Quadrilateral skisserar äggläggningsarenan för en enda fluga. E)Dag 0 för insamlade honor/hanar i en jästflaska. (F) Dag 4 - 5 av de insamlade honorna/hanarna i en jästflaska. Observera att larver och vuxna kvinnor har ätit det mesta av jästen och matens yta har blivit upptagen av larver. Den våta ytmaten som kryper med larver hindrar kvinnor från att lägga fler ägg i flaskan. (G)Schematisk avbildning av protokollet för att inrätta äggläggningsbeteendeexperiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Representativa äggläggningsresultat för flugor Välja mellan sackaros och vanliga substrat. A)Sidovy över äggläggningsresultat av vilda flugor när de fick välja mellan sackaros (150 mM) och vanliga substrat. Vit låda skisserar en äggläggningsarena för en enda fluga. B) Överst i äggläggningsresultaten. Vit låda skisserar en äggläggningsarena för en enda fluga. C)Preferensindex (PI) av vild typ flyger när man ombeds välja mellan ett sackaroshaltigt substrat och ett vanligt substrat. PI för varje hona beräknas enligt följande: (antal ägg på sackarossubstrat - antal ägg på de vanliga substraten)/totalt antal ägg. Felfältet anger SEM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Tekniska ritningar för avdelaren och kammarens substratstycke. (A-A") Olika vyer av kammarens substratbit. (B-B') Olika vyer av mitten av avdelaren i kammaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 2: Tekniska ritningar för kammarens laststycke. Jagär inte så bra på att se till att det finns en Olika vyer av det övre lagret av kammarens lastpjäs. (B-B') Olika vyer av det nedre lagret av kammarens lastpjäs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 3: Teknisk ritning för skjutdörren och skenan på kammaren. A)Skenan fastsatt på kammarens övre del. B)Skjutdörren till kammaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC