Drosophila ( Drosophila ) Test de préférence pour la ponte : une méthode pour tester la prise de décision chez les mouches

Overview

Les femelles drosophiles choisissent entre les substrats et certains sites attrayants pour la ponte. Cette vidéo décrit un test comportemental qui teste leur prise de décision, appelée l’analyse de préférence de ponte. Le clip présenté démontre la procédure avec une configuration sur mesure, qui permet aux chercheurs non seulement de tester le comportement de nombreuses femmes en même temps, mais est également compatible avec l’enregistrement vidéo et les configurations optogénétiques.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Gou et coll.,High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).

1. Construction de chambre, assemblée, configuration d’essai

1. Faire construire des chambres de ponte acryliques par un atelier d’usinage(figure 1A-D). Le dessin d’ingénierie de différentes pièces a été montré dans la figure supplémentaire 1-3. Des images haute résolution peuvent également être trouvéesici (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Insérez des feuilles de plastique dans le chargement (en haut) de la chambre, comme le montre la figure 1C. Cela sert de surface inférieure pendant le chargement des mouches dans les arènes individuelles de ponte.
3. Anesthésier les femelles sur un tampon de CO_{2 et} les charger individuellement dans chaque arène de ponte. Prévoyez ~30 min pour que les mouches se remettent du CO₂ et s’acclimatent au nouvel environnement.
4. Préparer les substrats d’agarose.
   1. Pour plus de commodité, conservez une bouteille préfabriquée de 1 % d’agarose fondue dans un bain d’eau de 55 °C.
   2. Ajouter la quantité désirée de solution de saccharose (2 M) dans un tube conique de 50 ml et mélanger avec la quantité appropriée d’agarose. Par exemple, pour préparer le substrat de saccharose de 150 mM, placez 750 μl de solution de saccharose de 2 M dans le tube, puis remplissez le tube d’agarose à la marque de 10 ml.
   3. Préparer le substrat nature de la même manière, mais ajouter de l’eau distillée au lieu de solution de saccharose.
      REMARQUE: La concentration finale d’agarose dans ce protocole est légèrement inférieure à 1%. D’après notre expérience, la concentration exacte d’agarose n’a pas d’importance tant qu’elle est contrôlée pour être à ~0,9 - 1,1% et que les deux substrats sont de la même concentration d’agarose.
5. Prenez le substrat (en bas) de la chambre et pipette 1000 μl de substrat d’agarose dans chaque auge comme on le voit dans la figure 1D.
6. Laisser l’agarose se solidifier pendant ~30 min.
7. Une fois que les substrats et les mouches de l’agarose sont prêts, assembler les trois morceaux de la chambre de ponte, puis sortir les feuilles de plastique.
8. Placez les chambres dans des incubateurs à mouches.
   REMARQUE: La durée des expériences de ponte peut varier en fonction des besoins expérimentaux. Nous dirigeons généralement l’expérience O/N (14 - 16 heures). En outre, aucun impact significatif du moment circadien sur les préférences de ponte n’a été observé.
9. Anesthésier les femelles en injectant du CO₂ dans la chambre. Démonter la chambre, jeter les mouches anesthésiées dans fly morgue(c.-à-d.,une boîte de café vide remplie d’huile de maïs). Prenez des photos des résultats pour la tenue des dossiers (voir la figure 2).
10. Comptez manuellement le nombre d’œufs et calculez les indices de préférence pour analyse. Calculer l’indice de préférence comme (N_a - N_b)/(N_a + N_b)où N_{a et} N_{b représentent} le nombre d’œufs sur le site a par rapport au site b, respectivement.

Representative Results

Figure 1 : Chambres de ponte et protocole de ponte. (A) Chambre de ponte entièrement assemblée. (B) Pièces démontées. a : la pièce de chargement (en haut), b : la pièce séparateur (au milieu), c : le substrat (en bas). Les dessins techniques de ces pièces sont présentés dans la figure supplémentaire 1-3. (C) Le morceau de chargement de la chambre. a': portes coulissantes, a »: rails. Les feuilles de plastique sont insérées dans la pièce de chargement pour servir de plancher pour maintenir les mouches chargées en place. Nous mettons généralement des rubans couleur sur le bord des feuilles de plastique (flèche rouge). (D) Le substrat (en bas) et le diviseur (milieu) des morceaux de la chambre. L’agarose est déposée dans des auges individuelles pour servir de substrats pondant des œufs (flèches). Quadrilateral décrit l’arène de ponte pour une seule mouche. (E) Jour 0 des femelles/mâles recueillis dans un flacon levure. (F) Jour 4 - 5 des femelles/mâles recueillis dans un flacon levure. Notez que les larves et les femelles adultes ont mangé la majeure partie de la levure et que la surface de la nourriture est occupée par les larves. Les aliments humides de surface rampant avec des larves empêchent les femelles de pondre plus d’œufs dans le flacon. (G) Schéma décrivant le protocole de mise en place d’expériences de comportement de ponte. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Résultats représentatifs de ponte pour les mouches choisissant entre le saccharose et les substrats ordinaires. (A) Vue latérale des résultats de ponte des mouches sauvages lorsqu’on leur a donné le choix entre le saccharose (150 mM) et les substrats ordinaires. La boîte blanche décrit une arène de ponte pour une seule mouche. (B) Vue supérieure des résultats de ponte. La boîte blanche décrit une arène de ponte pour une seule mouche. (C) Indice de préférence (PI) des mouches de type sauvage lorsqu’on leur demande de choisir entre un substrat contenant du saccharose et un substrat nature. Pi pour chaque femelle est calculé comme suit: (nombre d’oeufs sur substrat saccharose - nombre d’œufs sur les substrats ordinaires)/nombre total d’œufs. La barre d’erreur indique SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Dessins techniques pour le diviseur et la pièce de substrat de la Chambre. (A-A ») Différentes vues du morceau de substrat de la chambre. (B-B ') Différentes vues du morceau de diviseur moyen de la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Dessins d’ingénierie pour la pièce de chargement de la Chambre. (A-A ') Différentes vues de la couche supérieure de la pièce de chargement de la chambre. (B-B ') Différentes vues de la couche inférieure du morceau de chargement de la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 3 : Dessin d’ingénierie pour la porte coulissante et le rail sur la chambre. (A) Le rail fixé sur le morceau supérieur de la chambre. (B) La porte coulissante pour la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC