Drosophila Yumurtlama Tercihi Tahlil: Sineklerde Karar Vermeyi Test Etmek İçin Bir Yöntem

Overview

Drosophila dişileri, yumurtlama için çekici olan substratlar ve belirli siteler arasında seçim yapabilir. Bu videoda, yumurtlama tercihi testi adı verilen karar vermelerini test eden davranışsal bir test açıklanmaktadır. Öne çıkan klip, araştırmacıların sadece birçok kadının davranışını aynı anda test etmelerine değil, aynı zamanda video kaydı ve optogenetik kurulumlarla da uyumlu olan özel yapım bir kurulumla prosedürü göstermektedir.

Protocol

Bu protokol, Bireysel Drosophila melanogaster,J. Vis. Exp'inYumurtlama Tercihlerini İncelemek için Gou ve ark.,Yüksek Verim Tahlilinden bir alıntıdır. (2016). 

1. Oda İnşaatı, Montaj, Tahlil Kurulumu

1. Bir makine atölyesinin akrilik yumurtlama odaları inşa ederek (Şekil 1A-D ) yapmasını sağlayın. Farklı parçaların mühendislik çizimi Ek Şekil 1-3'tegösterilmiştir. Yüksek çözünürlüklü resimlere buradan da ulaşabilirsiniz (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
2. Şekil 1C'degösterildiği gibi odanın yükleme (üst) parçasına plastik levhalar yerleştirin. Bu, sinekleri bireysel yumurtlama arenalarına yüklerken alt yüzey görevi görür.
3. Kadınları bir CO₂ pedinde uyuşturmak ve her yumurtlama arenasına ayrı ayrı yüklemek. Sineklerin CO 2'den kurtarılması ve yeni ortama alışması için_~30 dakika izin verin.
4. Agarose substratlarını hazırlayın.
   1. Kolaylık sağlamak için, 55 °C'lik bir su banyosunda önceden hazırlanmış bir şişe erimiş % 1 agarose bulundurun.
   2. İstediğiniz miktarda stok sakkaroz çözeltisini (2 M) 50 ml konik bir tüpe ekleyin ve uygun miktarda agarose ile karıştırın. Örneğin, 150 mM sakkaroz substratını hazırlamak için, 750 μl 2 M sakkaroz çözeltisini tüpe yerleştirin ve ardından tüpü 10 ml işaretine kadar agarose ile doldurun.
   3. Düz substratı aynı şekilde hazırlayın, ancak sakkaroz çözeltisi yerine damıtılmış su ekleyin.
      NOT: Bu protokoldeki son agarose konsantrasyonu% 1'den biraz daha azdır. Deneyimlerimize göre, agarose'un tam konsantrasyonu ~ 0.9 - 1.1% içinde kontrol edildikçe ve iki substrat aynı agarose konsantrasyonunda olduğu sürece önemli değildir.
5. Odanın substratını (alt) parçasını ve Pipet 1.000 μl agarose substratını Şekil 1D'degörüldüğü gibi her oluğa alın.
6. Agarose'un ~30 dakika katılaşmasına izin verin.
7. Agarose substratları ve sinekleri hazır olduğunda, yumurtlama odasının üç parçasını da birleştirin ve ardından plastik tabakaları çıkarın.
8. Odaları sinek inkübatörlerine yerleştirin.
   NOT: Yumurtlama deneylerinin uzunluğu deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak değişebilir. Genellikle O/N (14 - 16 saat) deneyini çalıştırırız. Ayrıca sirkadiyen zamanlamanın yumurtlama tercihleri üzerinde anlamlı bir etkisi gözlenmedi.
9. Odaya CO₂ enjekte ederek dişileri uyuşturun. Odayı sökün, uyuşturulmuş sinekleri sinek morguna atın(yani,biraz mısır yağı ile dolu boş bir kahve şişesi). Kayıt tutma için sonuçların fotoğraflarını çekin (bkz. Şekil 2).
10. Yumurta sayısını manuel olarak sayın ve analiz için tercih endekslerini hesaplayın. Tercih dizinini (N_a - N_b)/(Na + N _b) olarak hesaplayın;

Representative Results

Şekil 1: Yumurtlama Odaları ve Yumurtlama Protokolü. (A) Tamamen monte edilmiş yumurtlama odası. (B) Parçalara ayrılmış parçalar. a: yükleme parçası (üst), b: bölücü parça (orta), c: substrat (alt) parça. Bu parçaların mühendislik çizimleri Ek Şekil 1-3'tegösterilmiştir. (C) Haznenin yükleme parçası. a': süryen kapılar, a": raylar. Plastik levhalar, yüklü sinekleri yerinde tutmak için zemin görevi görmek üzere yükleme parçasına yerleştirilir. Genellikle plastik levhaların kenarına (kırmızı ok) renkli bantlar koyarız. (D) Odanın substratı (alt) ve bölücü (orta) parçaları. Agarose, yumurtlama substratları (oklar) olarak hizmet etmek için bireysel oluklara biriktirilir. Dörtgen, tek bir sinek için yumurtlama arenasını özetler. (E) Mayalı bir şişede toplanan dişi/erkeklerin 0. (F) Gün 4 - Mayalı bir şişede toplanan kadın / erkek 5. Larvaların ve yetişkin dişilerin mayanın çoğunu yediğini ve yiyeceklerin yüzeyinin larvalar tarafından işgal edilmiş olduğunu unutmayın. Larvalarla sürünen ıslak yüzeyli yiyecekler, dişilerin şişeye daha fazla yumurta koymasını önler. (G) Yumurtlama davranış deneyleri kurma protokolünü gösteren şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Sakkaroz ve Düz Substratlar Arasında Seçim Yapmak için Sinekler için Temsili Yumurtlama Sonuçları. (A) Sakkaroz (150 mM) ve düz substratlar arasında bir seçim verildiğinde yabani tip sineklerin yumurtlama sonuçlarının yan görünümü. Beyaz kutu, tek bir sinek için bir yumurtlama arenası özetler. (B) Yumurtlama sonuçlarının en iyi görünümü. Beyaz kutu, tek bir sinek için bir yumurtlama arenası özetler. (C) Sakkaroz içeren bir substrat ile düz bir substrat arasında seçim yapması istendiğinde vahşi tipte tercih indeksi (PI) uçar. Her dişi için PI aşağıdaki gibi hesaplanır: (sakkaroz substratındaki yumurta sayısı - düz substratlardaki yumurta sayısı)/toplam yumurta sayısı. Hata çubuğu SEM'i gösterir.

Ek Şekil 1: Bölücü ve Odanın Alt Tabaka Parçası için Mühendislik Çizimleri. (A-A") Odanın alt tabaka parçasının farklı görünümleri. (B-B') Odanın orta bölücü parçasının farklı görünümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Odanın Yükleme Parçası için Mühendislik Çizimleri. (A-A') Odanın yükleme parçasının üst tabakasının farklı görünümleri. (B-B') Odanın yükleme parçasının alt tabakasının farklı görünümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Süryani Kapı ve Oda Üzerindeki Ray için Mühendislik Çizimi. (A) Ray haznenin üst kısmına sabitlenmiştir. (B) Oda için süryani kapı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC