ショウジョウバエ 卵子の好みのアッセイ:ハエの意思決定をテストする方法

Overview

ショウジョウバエ の女性は、基材と産卵に魅力的な選択部位の間で選択します。このビデオでは、産卵好みのアッセイと呼ばれる意思決定をテストする行動アッセイについて説明します。注目のクリップは、研究者が同時に多くの女性の行動をテストするだけでなく、ビデオ録画や光遺伝学的セットアップと互換性を持つカスタムメイドのセットアップで手順を示しています。

Protocol

このプロトコルは、Gouらからの抜粋です, 個々のショウジョウバエメラノガスターの卵を産む好みを調べるためにハイスループットアッセイ,J. Vis. Exp.(2016). 

1. チャンバー建設、組立、アッセイセットアップ

1. 機械店にアクリル産卵室を作ってみて下す(図1A-D)。異なる部分の工学図面を 補助図1-3に示した。高解像度の画像もここにあります (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf)。
2. 図 1Cに示すように、プラスチックシートをチャンバのローディング (上) 部分に挿入します。これは、個々の産卵アリーナにハエをロードしながら、底面として機能します。
3. CO2パッドで女性を麻酔し、各産卵場に個別にロードします。ハエが_CO2から回復し、新しい環境に慣れるために〜30分を許可します。
4. アガロース基板を準備します。
   1. 便宜上、55°Cの水浴で溶かした1%アガロースの予め作られたボトルを保管してください。
   2. 所望の量のストックスクロース溶液(2M)を50ml円錐管に加え、適量のアガロースと混合します。例えば、150 mMのショ糖基板を調製し、2Mスクロース溶液の750 μlをチューブに入れ、その後、チューブを10mlのマークにアガロースで充填します。
   3. プレーン基板も同様に準備しますが、スクロース溶液の代わりに蒸留水を加えます。
      注: このプロトコルにおけるアガロースの最終濃度は1%よりわずかに少ない。我々の経験では、アガロースの正確な濃度は、それが〜0.9〜1.1%以内に制御され、2つの基質が同じアガロース濃度である限り、重要ではありません。
5. 図1Dに示すように、チャンバーの基板(底)片と1,000μlのアガロース基板を各トラフに取り込みます。
6. アガロースを30分間固める。
7. アガロースの基質とハエが準備ができたら、産卵室の3つの部分をすべて組み立ててから、プラスチックシートを取り出します。
8. フライインキュベーターにチャンバーを置きます。
   注: 産卵実験の長さは、実験のニーズによって異なる場合があります。通常、実験 O/N (14 - 16 時間) を実行します。また、産卵の好みに対する概日のタイミングの有意な影響は認められない。
9. 部屋に_CO2 を注入することによって女性を麻酔する。チャンバーを分解し、麻酔を受けたハエをフライ遺体安置所に捨てる(すなわち、空のコーヒーがトウモロコシ油で満たされる)。記録管理の結果を撮影します ( 図 2を参照)。
10. 手動で卵の数をカウントし、分析のための優先度インデックスを計算します。設定インデックスを計算する (N_a - N b)/(N_a + N_b) N_aと N_bはそれぞれサイト a とサイト b の卵の数を表します。

Representative Results

図1:産卵室と産卵プロトコル。(A)完全に組み立てられた産卵室。(B) 分解された部分。a:ローディングピース(上)、b:仕切り片(中央)、c:基板(下)ピース。これらの部品の設計図を補足図 1-3に示します。(C)チャンバーのローディング部分。a':引き戸、a":レール。プラスチックシートは、装填されたハエを所定の位置に保つために床として機能するために、ローディングピースに挿入されます。私たちは通常、プラスチックシートの端にカラーテープを置きます(赤い矢印)。(D)基板(底部)とチャンバの仕切り(中央)片。アガロースは、産卵基材(矢)として機能するために個々のトラフに堆積される。四辺形は、単一のハエのための産卵アリーナの概要を説明します。(E) 酵母バイアルに集められた雌/男性の0日目。(F)4日目 - 酵母バイアルに集められた雌/男性の5。幼虫や成人女性は酵母のほとんどを食べており、食べ物の表面は幼虫によって占められるようになっています。幼虫で這う濡れた表面食品は、女性がバイアルでより多くの卵を産むのを防ぎます。(G) 産卵行動実験のプロトコルを描いた回路図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:ショ糖とプレーン基質の間で選択するハエの代表的な卵子産結果。(A)野生型ハエの産卵結果のサイドビューは、スクロース(150mM)とプレーン基質の間で選択を与えられた。白い箱は単一のハエのための1つの産卵アリーナを概説する。(B)産卵結果のトップビュー。白い箱は単一のハエのための1つの産卵アリーナを概説する。(C)スクロース含有基板とプレーン基板から選択を求められた野生型ハエの好み指数(PI)。各雌のPIは、次のように計算されます:(スクロース基質上の卵の数 - プレーン基質上の卵の数)/卵の総数。エラーバーはSEMを示しています。

補足図1:チャンバーのディバイダーと基板の図面。(A-A")チャンバーの基板部分の異なるビュー。(B-B')部屋の中央の仕切り片の異なる眺め。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図2:チャンバーのローディングピースのエンジニアリング図面。(A-A')チャンバーのローディングピースの上層の異なるビュー。(B-B')チャンバーのローディングピースの底層の異なるビュー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図3:引き戸と室内のレールのエンジニアリング図面(A)レールはチャンバーの一番上に固定されています。(B) チャンバーの引き戸。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500-500
Sucrose	Sigma	S0389
Water bath	Fisher	15-462-6Q
Egg-laying chambers	Custom Built
Fly vials (narrow)	Genesee	32-116BC