C. elegans Dissecção blastomere: um método para remover a casca de ovo e dissociar células embrionárias

Overview

Este vídeo introduz um método de isolar C. elegans blastomeres de embriões primitivos.  As células resultantes são adequadas para cultura celular ou experimentos ex vivo.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Hsu et al,   In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato Celular Espacial com Caenorhabditis Isolado elegans Embryo Blastomeres e Contas de Poliestireno Adesivo, J. Vis. Exp. (2019).

1. Isolamento do blastomere de embrião
2. Use luvas e jaleco para evitar corte e contato com a solução de branqueamento.
   1. Segure cada extremidade de um microcapilar (capacidade; 10 μL) com a mão direita e esquerda.
   2. Puxe o microcapilário para ambas as extremidades para aplicar tensão e traga o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão(Figura 1A).
   3. Corte as pontas dos capilares puxados à mão com fórceps sob o microscópio dissecando e conecte o capilar puxado em um aparelho de pipetação bucal. Prepare dois tipos de pipetas. Os tamanhos de abertura da ponta para as pipetas devem ser de aproximadamente 2x e 1x o comprimento curto do eixo dos embriões C. elegans (30 μm) para a transferência de embriões e remoção de casca de ovo, respectivamente Figura 1B-D).
   4. Pipeta 45 μL de solução de sal de ovo em um poço de um slide multiwell(Figura 2A; inferior).
   5. Coloque 5-10 C. elegans adultos em uma solução de sal de ovo bem contendo.
   6. Para obter os embriões C. elegans precoces, corte os adultos em pedaços, posicionando duas agulhas para a direita e para a esquerda do corpo de C. elegans e deslizando as agulhas um pelo outro (Figura 2A; esquemas superiores).
   7. Pipeta 45 μL de solução hipoclorito em um poço próximo ao poço contendo solução de sal de ovo(Figura 2B).
   8. Pipeta 45 μL do meio de crescimento de Shelton sobre os três poços subsequentes ao lado da solução de hipoclorito contendo poço(Figura 2B).
   9. Transfira embriões de estágio de 1 célula e estágio inicial de 2 células para a solução de hipoclorito por tubos bucais com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões(Figura 2B).
   10. Espere por 40-55 s.
   11. Lave os embriões transferindo os embriões da solução de hipoclorito para o meio de crescimento de Shelton por tubos bucais com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões(Figura 2B).
   12. Lave os embriões novamente transferindo os embriões para um novo poço do meio de crescimento de Shelton por tubos bucais com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões(Figura 2B).
   13. Transfira os embriões lavados para um novo poço do meio de crescimento de Shelton por pipetação bucal com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões. Utilizando o capilar desenhado à mão para a remoção da casca de ovo, repita cuidadosamente a pipetação (Figura 2C; esquemas médios). Se a casca de ovo for removida com sucesso, as células embrionárias se tornarão mais esféricas(Figura 2C; à direita).
   14. Separe os blastomeres embrionários do estágio 2 por tubos suaves e continuamente com o capilar desenhado à mão para a remoção da casca de ovo(Figura 2D).

Figura 1: Isolamento blastomere. (A) Puxão de mão de capilar de vidro. (B) Capilar de vidro desenhado à mão para transferência de embriões. (C) Capilar de vidro desenhado à mão para remoção de casca de ovo. (D) Esquemas mostrando o tamanho adequado da abertura capilar para a remoção da casca de ovo. Flechas indicam embriões. Barras de escala mostram 100 μm.

Figura 2: Fluxo de trabalho de isolamento blastomere. (A) Dissecção de C. elegans adultos em tampão de sal de ovo para obter embriões. As fotografias mostram embriões de estágio de 2 células e 4 células antes da remoção da casca de ovo. (B) Tratamento e lavagem de hipoclorito. (C) Os esquemas retratam o tempo adequado para a remoção da casca de ovo. A fotografia mostra um embrião de estágio de 4 células após a remoção da casca de ovo. (D)Separação blastomere. A fotografia mostra um embrião separado de 2 células. Os tamanhos das setas em C e D indicam as forças relativas necessárias durante a pipetação. Barras de escala mostram 50 μm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type	Caenorhabditis Genetics Center	N2	Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37	in house	KSG5	Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL	Drummond	21-180-13	For the blastomere isolation
CD Lipid Concentrate	Life Technologies	11905031	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox	Clorox	N. A.	For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder	In house	N.A.	For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X.	Carl Zeiss	Stemi 508	For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin	Gibco	A3160701	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge	BD	14-826AA	For the blastomere isolation
Inulin	Alfa Aesar	AAA1842509	For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x)	Gibco	11120052	For the blastomere isolation.
Multitest Slide 10 Well	MP Biomedicals	ICN6041805	For the blastomere isolation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140148	For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone	Fisher BioReagents	BP431-100	For the blastomere isolation
Potassium Chloride	Bioshop	POC888	For the blastomere isolation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium	Gibco	21720024	For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride	Bioshop	SOD001	For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N	Fisher Chemical	SS255-1	For the blastomere isolation
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile	Basix	13100115	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-862	For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm	Saint Gobain Performance Plastics	89403-854	For the blastomere isolation.