포토모터 반응 분석: 라발 제브라피쉬의 행동 반응을 측정하여 조명 상태의 급격한 변화에 대한 측정 방법

Overview

이 비디오는 자동 추적 소프트웨어를 사용하여 제브라피시와 팻 헤드 minnow 애벌레의 광모터 반응 분석에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 조명 상태의 급격한 변화에 따라 애벌레 물고기의 행동 반응을 측정합니다.

Protocol

1. 비디오 추적 매개 변수 의 보정

1. 행동 측정에 앞서 비디오 트랙 소프트웨어에서 관찰 및 교정 매개 변수를 설정합니다(재료 표 참조).
   1. 개인 우물에 적어도 1 개의 애벌레 물고기와 녹음 챔버에 잘 접시를 놓습니다. 플레이트및 관련 어류를 표현으로 사용하여 교정 매개변수를 설정합니다.
   2. 비디오 트랙 소프트웨어에서 "파일 | 클릭합니다. 프로토콜 생성"을 생성하여 "프로토콜 생성 마법사" 대화 상자를 엽니다. "위치 수" 필드에서 웰 플레이트의 개인 우물 수를 입력한 다음 "확인"을 클릭합니다.
   3. 화면 상단에서 "보기 | 전체 화면", 이는 시스템이 웰 플레이트의 오버 헤드 카메라 보기를 표시하는 메시지를 표시합니다.
   4. 세 가지 여러 가지 모양으로 표시되는 "영역 그리기" 아이콘을 클릭합니다. 웰 플레이트 보기 영역의 오른쪽에는 "영역"이라고 표시된 필드의 원 아이콘을 선택합니다.
   5. 커서를 사용하여 웰 플레이트의 왼쪽 상단에 있는 원형 비디오 추적 영역을 묘사합니다. "오른쪽 상단 표시"를 선택한 다음 오른쪽 상단의 보기 영역을 잘 간략하게 설명합니다. 그런 다음 "하단 표시"를 선택하여 오른쪽 하단을 잘 윤곽을 설명합니다.
      참고: 원형 윤곽선을 그린 후 위치를 조정해야 할 수 있습니다.  윤곽선의 위치를 조정하려면 "선택"을 클릭한 다음 커서를 사용하여 설명된 영역을 이동합니다. 또한 "복사"를클릭한 다음"붙여넣기"를클릭하여 윤곽선을 복제할 수 있습니다.
   6. 왼쪽 위, 오른쪽 상단 및 오른쪽 오른쪽 오른쪽 잘 추적 영역이 정의된 후 "빌드"를 클릭하여 소프트웨어에 메시지를 표시하여 나머지 우물의 보기 영역을 자동으로 설명합니다.
   7. "교정"이라고 표시된 영역에서 "배율 그리기"를 클릭합니다. 커서를 사용하여 플레이트를 가로질러 수평 선을 그립니다. 선을 그려지면 "교정 측정"이라고 표시된 대화 상자가 나타납니다. 웰 플레이트 길이를 입력하고 "OK"를 클릭합니다.
   8. "그리기 영역" 아이콘을 클릭하여 도면 관리자를 종료합니다.
   9. "타일" 아이콘을 클릭합니다.  커서를 사용하여 각 상자가 녹색이 되도록 보기 화면에 나타나는 모든 상자를 강조 표시합니다.
      참고: 타일 아이콘은 여섯 개의 개별 작은 사각형의 그룹으로 나타납니다
   10. "보기를 클릭합니다| 전체 화면".  플레이트 보기 영역의 오른쪽에는 "감지 임계값"이라고 표시된 상자에서 "Bkg"을 클릭합니다. 임계값 조정 표시줄을 사용하여 픽셀 감지 임계값을 설정합니다. 적절한 픽셀 감지 임계값을 선택한 후 "그룹에 적용"을 클릭합니다.
       참고: 이 프로토콜은 제브라피시 관측을 위한 검지 임계값을 검정 모드13로 설정하고, 지두민노 관찰을 위한 투명 모드에서 110으로 설정합니다.
   11. "이동 임계값"이라고 표시된 상자에 원하는 이동 속도 추적 매개 변수를 입력합니다. 속도 매개 변수가 설정되면 "그룹에 적용"을 클릭합니다.
       참고: 이 프로토콜은 20mm/s에서 크고 작은 움직임을 5mm/s로 설정합니다. 이러한 선택은 비활성(동결) = & 5mm/s, 소형(순항) = 5-20mm/s, 대형(파열) = >20mm/s의 세 가지 속도 수준에서 애벌레 물고기의 움직임을 추적하는 소프트웨어를 프로그래밍합니다.
   12. "매개 변수 | 클릭 드롭다운 메뉴에서 프로토콜 매개 변수". 대화 상자에서 "시간" 탭을 선택합니다. 관찰 시간과 통합 시간을 입력합니다. 매개 변수를 입력 한 후 "확인"을 클릭합니다.
   13. 각 광에 대한 빛/어두운 광기간 시간과 광 강도를 설정하려면 "매개 변수" 드롭다운 메뉴에서 "라이트 드라이빙"을 선택하여 라이트 드라이버 설정 대화 상자를 엽니다.
       참고: 여러 밝은 광기간을 설정하기위한 프로토콜 비디오를 참조하십시오.
   14. 비디오 추적 매개 변수가 설정된 후 관찰 프로토콜을 저장합니다.
       참고: 이 프로토콜은 10 분 적응 단계를 포함하는 50 분 기간 동안 물고기 행동을 관찰하고 2 10 분 광 기간과 2 개의 10 분 어두운 기간으로 구성된 4 개의 변경 빛 / 어두운 위상이 있습니다. 통합 시간은 50분 행동 평가판의 매 분마다 동작을 측정하도록 설정되어 있습니다.

2. 라발 물고기 운동 및 광운동 행동의 관찰

1. 실험어가 포함된 웰 플레이트를 행동 기록실에 놓습니다.
2. 비디오 추적 소프트웨어에서 다음 단계에서 개발된 추적 프로토콜을 엽니다.
3. 비디오 추적 뷰어에서 모든 애벌레가 컴퓨터 화면에 표시되고, 개별 애벌레가 각 우물에 하나만 존재하며, 개별 우물이 1.1.5 단계와 1.1.6 단계에서 정의된 관측 영역 내에 정렬되어 있는지 확인하십시오.
4. "실험 | 클릭하십시오. 실행".
   참고: 시스템은 관찰 데이터를 저장하는 이름과 위치를 제공하기 위해 사용자에게 메시지를 표시합니다.
5. 관찰 데이터의 이름과 저장 위치가 지정되면 "여러 라이브 이미지" 아이콘을 클릭하여 미리 정의된 모든 보기 영역을 강조 표시합니다.
   참고: 이 아이콘은 컴퓨터 화면 상단에 위치하며 네 개의 작은 사각형으로 나누어 진 상자로 나타납니다. 이 아이콘을 클릭하면 미리 정의된 모든 보기 영역이 강조 표시됩니다.
6. 레코딩 챔버의 패널을 닫고 "배경 | 클릭합니다. 컴퓨터 모니터에서 시작".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers