光運動応答アッセイ:照明状態の急激な変化に対する幼虫ゼブラフィッシュの行動応答を測定する方法

Overview

このビデオでは、自動追跡ソフトウェアを使用したゼブラフィッシュとファットヘッドミノー幼虫の光運動応答アッセイについて説明します。このプロトコルは、照明状態の急激な変化に続く幼虫魚の行動応答を測定する。

Protocol

1. ビデオトラッキングパラメータのキャリブレーション

1. 行動対策の前に、ビデオトラックソフトウェアで観察パラメータとキャリブレーションパラメータを設定します(資料表を参照)。
   1. 個人の井戸に少なくとも1匹の幼虫魚を持つ記録室に井戸プレートを置きます。キャリブレーションパラメータを設定するには、プレートと関連する魚をリプレゼンテーションとして使用します。
   2. ビデオトラックソフトウェアで、「ファイル」をクリック|「プロトコル作成ウィザード」ダイアログボックスを開く「プロトコルを生成」。「ロケーション数」フィールドに、ウェルプレートの個体数を入力し、「OK」をクリックします。
   3. 画面の上部にある [表示] をクリック|フルスクリーン」は、システムにウェルプレートのオーバーヘッドカメラビューを表示するように促します。
   4. 3 つの多色図形として表示される [領域の描画] アイコンをクリックします。ウェルプレート表示領域の右側にある「Areas」というラベルのフィールドで円のアイコンを選択します。
   5. カーソルを使用して、ウェル プレートの左上ウェルにある円形のビデオ トラッキング領域を描きます。「右上マーク」を選択し、右上の表示領域の輪郭を描きます。次に、右下のアウトラインを表示するには、[下マーク]を選択します。
      メモ: 円形の輪郭を描いた後、その位置を調整する必要があります。 アウトラインの位置を調整するには、「選択」をクリックし、カーソルを使用して輪郭を描いた領域を移動します。また、アウトラインは、[コピー] をクリックし、[貼り付け] をクリックして複製することもできます。
   6. 左上、右上、右下のトラッキング領域を定義したら、「ビルド」をクリックして、残りのウェルの表示領域を自動的に示すプロンプトを表示します。
   7. 「キャリブレーション」と表示されている領域で、「スケールを描画」をクリックします。カーソルを使用してプレートを横切る水平線を描画します。線が引かれると、「キャリブレーション測定」というラベルのダイアログボックスが表示されます。ウェルプレートの長さを入力し、「OK」をクリックします。
   8. [領域を描画]アイコンをクリックして、図面マネージャを終了します。
   9. 「タイル」アイコンをクリックします。 カーソルを使用して、表示画面に表示されるすべてのボックスをハイライト表示して、各ボックスが緑色になるようにします。
      注: [タイル] アイコンは、6 つの小さな正方形のグループとして表示されます。
   10. "[表示] をクリックします|フルスクリーン」。 プレート表示領域の右側にある「検出しきい値」というラベルのボックスで「Bkg」をクリックします。ピクセル検出のしきい値を設定するには、しきい値調整バーを使用します。適切なピクセル検出しきい値が選択されたら、「グループに適用」をクリックします。
       注: このプロトコルは、検出しきい値を、ゼブラフィッシュ観測では黒モードでは 13、ファットヘッド ミノー観測では透過モードでは 110 に設定します。
   11. 「移動しきい値」というラベルのボックスに、希望の移動速度の追跡パラメータを入力します。速度パラメータを設定したら、「グループに適用」をクリックします。
       メモ: このプロトコルは、小さな/大きな動きを 20 mm/s、非アクティブ/小動きを 5 mm/s に設定します。これらの選択は、3つの異なる速度レベルで幼虫魚の動きを追跡するためのソフトウェアをプログラムします:非アクティブ(凍結)= <5 mm/s、小(クルージング)= 5〜20 mm/s、および大(破裂)= >20 mm/s。
   12. 「パラメータ」をクリック|ドロップダウン メニューからプロトコル パラメーター」ダイアログボックスで、「時刻」タブを選択します。観測時間と統合時間を入力します。パラメータを入力したら、[OK]をクリックします。
   13. 光/暗い光周期の時間と光の強度を各々の光周期に設定するには、「パラメータ」ドロップダウンメニューから「軽い運転」を選択して、ライトドライバ設定ダイアログボックスを開きます。
       メモ: 複数の明暗光周期を設定するプロトコルビデオを参照してください。
   14. ビデオトラッキングパラメータを設定したら、監視プロトコルを保存します。
       注:このプロトコルは、10分順応フェーズを含む50分の期間にわたって魚の挙動を観察し、その後に2つの10分光周期と2つの10分暗い期間からなる4つの変化する明暗相を含みます。統合時間は、50分の行動試行の毎分の動作を測定するように設定されています。

2. ラーバル魚ロコモーターの観察と光運動の挙動

1. 実験魚を含むウェルプレートを行動記録室に設置します。
2. ビデオトラッキングソフトウェアで、次のステップで開発したトラッキングプロトコルを開きます。
3. ビデオ追跡ビューアで、すべての幼虫がコンピュータ画面に表示されていること、各井戸に個々の幼虫が1つしか存在しない、個々の井戸がステップ1.1.5と1.1.6で定義された観察領域内に整列されていることを確認します。
4. 「実験|実行する"。
   メモ: システムは、観測データを保存するための名前と場所を指定するようユーザーに求めます。
5. 観測データの名前と保存場所を指定したら、「複数のライブ画像」アイコンをクリックして、事前に定義されたすべての表示領域をハイライト表示します。
   メモ: このアイコンはコンピュータ画面の上部にあり、4 つの小さな四角形に分割されたボックスとして表示されます。このアイコンをクリックすると、事前に定義されたすべての表示領域がハイライト表示されます。
6. 記録室のパネルを閉じ、「背景|コンピュータモニタで開始」。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers