Photomotor Response Assay: En metode til at måle adfærdsmæssige reaktion Larve Zebrafish til en pludselig ændring i belysning tilstand

Overview

Denne video beskriver fotomotorisk responsanalyse af zebrafisk og fathead minnow larver ved hjælp af en automatiseret sporingssoftware. Protokollen måler larvefiskens adfærdsmæssige reaktion efter en pludselig ændring i belysningstilstanden.

Protocol

1. Kalibrering af videosporingsparametre

1. Forud for adfærdsmæssige foranstaltninger, sæt observation og kalibrering parametre i video track software (se Tabel over materialer).
   1. Placer en brøndplade i optagekammeret med mindst 1 larvefisk i en individuel brønd. Brug pladen og tilhørende fisk som repræsentationer for at indstille kalibreringsparametre.
   2. Klik på "Fil | Generer protokol", som åbner dialogboksen "guiden Til oprettelse af protokoller". Angiv antallet af personers brønde på brøndpladen i feltet "Placeringsantal", og klik derefter på "OK".
   3. Klik på "Vis | øverst på skærmen Fuld skærm", som vil bede systemet om at vise en overhead kameravisning af brøndpladen.
   4. Klik på ikonet "Tegn områder", der vises som tre flerfarvede figurer. Til højre for visningsområdet for brøndpladen skal du vælge cirkelikonet i feltet med navnet "Områder".
   5. Brug markøren til at afgrænse det cirkulære videosporingsområde øverst til venstre på brøndpladen. Vælg "Top-højre-mærke", og konturer derefter visningsområdet for den øverste højre brønd. Vælg derefter "Nederste mærke" for at skitsere den nederste højre brønd.
      BEMÆRK:Når den cirkulære kontur er tegnet, skal dens placering sandsynligvis justeres.  Hvis du vil justere dispositionens placering, skal du klikke på "marker" og derefter bruge markøren til at flytte dispositionsområdet. Konturer kan også replikeres ved at klikke på "Kopier" og derefter på "Sæt ind".
   6. Når de øverste venstre, øverste højre og nederste højre godt sporingsområder er defineret, skal du klikke på "Byg" for at bede softwaren om automatisk at afgrænse visningsområderne for de resterende brønde.
   7. Klik på "Tegn skala" i området "Kalibrering". Brug markøren til at tegne en vandret streg hen over pladen. Når linjen er tegnet, vises en dialogboks med navnet "Kalibreringsmåling". Angiv brøndpladens længde, og klik på "OK".
   8. Afslut tegnelederen ved at klikke på ikonet "Tegn områder".
   9. Klik på ikonet "Fliser".  Ved hjælp af markøren skal du markere alle de bokse, der vises på visningsskærmen, så hver boks er grøn.
      BEMÆRK:Ikonet Fliser vises som en gruppe på seks individuelle små firkanter
   10. "Klik på Vis| Fuld skærm".  Til højre for pladevisningsområdet skal du klikke på "Bkg" i boksen med navnet "Registreringstærskel". Brug tærskeljusteringslinjen til at angive grænseværdien for pixelregistrering. Når den relevante grænse for pixelregistrering er valgt, skal du klikke på "Anvend på gruppe".
       BEMÆRK:Denne protokol fastsætter detektionstærsklen til 13 i sort tilstand for zebrafiskobservationer og ved 110 i gennemsigtig tilstand for fathead minnow observationer.
   11. Angiv de ønskede hastighedssporingsparametre for bevægelse i boksen med navnet "Bevægelsestærskel". Når hastighedsparametrene er angivet, skal du klikke på "Anvend på gruppe".
       BEMÆRK: Denne protokol indstiller små/store bevægelser ved 20 mm/s og inaktive/små bevægelser ved 5 mm/s. Disse valg programmerer softwaren til at spore larvefiskebevægelser ved tre forskellige hastighedsniveauer: inaktiv (frysning) = <5 mm/s, lille (cruising) = 5-20 mm/s og stor (sprængning) = >20 mm/s.
   12. Klik på "Parametre | Protokolparametre" fra rullemenuen. Vælg fanen "Klokkeslæt" i dialogboksen . Angiv observationstiden og integrationstiden. Når parametrene er angivet, skal du klikke på "OK".
   13. Hvis du vil indstille de lyse/mørke fotoperioder og lysintensiteten for hver fotoperiode, skal du åbne dialogboksen med lysdriverindstillinger ved at vælge "Lys kørsel" i rullemenuen "Parametre".
       BEMÆRK:Se protokolvideo for at indstille flere lyse mørke fotoperioder.
   14. Når videosporingsparametrene er angivet, skal du gemme observationsprotokollen.
       BEMÆRK:Denne protokol observerer fisk adfærd over en 50 min periode, der omfatter en 10 min akklimatisering fase efterfulgt af 4 ændre lys / mørke faser bestående af to 10 min lys perioder og to 10 min mørke perioder. Integrationstiden er indstillet til at måle adfærd for hvert minut af det 50 minutters adfærdsmæssige forsøg.

2. Observation af larvefiskelokomotorisk og fotomotorisk adfærd

1. Placer brøndpladen, der indeholder eksperimentelle fisk, i det adfærdsmæssige optagelseskammer.
2. Åbn den sporingsprotokol, der er udviklet i næste trin, i videosporingssoftwaren.
3. I videosporingsfremviseren skal du kontrollere, at alle larver er synlige på computerskærmen, at der kun er en individuel larve til stede i hver brønd, og at individuelle brønde er justeret inden for de observationsområder, der blev defineret i trin 1.1.5 og 1.1.6.
4. Klik på "Eksperimentér | Udfør".
   BEMÆRK:Systemet beder brugeren om at angive et navn og en placering for at gemme observationsdataene.
5. Når observationsdataenes navn og gemme placering er angivet, skal du klikke på ikonet "Flere livebilleder" for at fremhæve alle de foruddefinerede visningsområder
   BEMÆRK:Dette ikon er placeret øverst på computerskærmen og vises som en boks opdelt i fire mindre firkanter. Hvis du klikker på dette ikon, fremhæves alle de foruddefinerede visningsområder.
6. Luk panelet i optagelseskammeret, og klik på "Baggrund | Start" på computerskærmen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers