Fotomotorisk svarsanalys: En metod för att mäta larv zebrafiskens beteendemässiga svar på en plötslig förändring i belysningstillståndet

Overview

Den här videon beskriver den fotomotoriska svarsanalysen av zebrafisk och fathead minnow larver med hjälp av en automatiserad spårning programvara. Protokollet mäter larvens beteendemässiga svar efter en plötslig förändring i belysningstillståndet.

Protocol

1. Kalibrering av videospårningsparametrar

1. Före beteendemått ställer du in observations- och kalibreringsparametrar i videospårprogramvaran (se Materialförteckning).
   1. Placera en brunnsplatta i inspelningskammaren med minst 1 larvfisk i en enskild brunn. Använd plattan och tillhörande fisk som representationer för att ställa in kalibreringsparametrar.
   2. Klicka på "Fila bort | i videospårprogramvaran" Generera protokoll", som öppnar en dialogruta för att skapa protokoll. I fältet "Platsantal" anger du antalet enskilda brunnar på brunnsplattan och klickar sedan på "OK".
   3. Högst upp på skärmen klickar du på "Visa | Helskärm", vilket kommer att uppmana systemet att visa en överliggande kameravy av brunnsplattan.
   4. Klicka på ikonen "Rita områden", som visas som tre flerfärgade former. Till höger om brunnsplattans visningsområde väljer du cirkelikonen i fältet märkt "Områden".
   5. Använd markören för att avgränsa det cirkulära videospårningsområdet i brunnsplattans övre vänstra brunn. Välj "Övre högra markering" och skissera sedan visningsområdet för den övre högra brunnen. Välj sedan "Nederkantsmarkering" för att beskriva den nedre högra brunnen.
      OBS:När du har ritat den cirkulära konturen måste dess position sannolikt justeras.  Om du vill justera dispositionens position klickar du på "markera" och använder sedan markören för att flytta det konturerade området. Konturer kan också replikeras genom att klicka på "Kopiera" och sedan "Klistra in".
   6. När områdena längst upp till vänster, uppe till höger och längst ned till höger har definierats klickar du på "Bygg" för att uppmana programvaran att automatiskt avgränsa visningsområdena för de återstående brunnarna.
   7. Klicka på Rita skala i området med etiketten "Kalibrering". Använd markören för att rita en vågrät linje över plattan. När linjen har ritats visas en dialogruta med etiketten "Kalibreringsmätning". Ange brunnsplattans längd och klicka på "OK".
   8. Avsluta ritningshanteraren genom att klicka på ikonen "Rita områden".
   9. Klicka på ikonen "Paneler".  Markera alla rutor som visas på visningsskärmen med hjälp av markören så att varje ruta är grön.
      IkonenPaneler visas som en grupp med sex enskilda små rutor
   10. "Klicka på Visa| Helskärm".  Till höger om plåtvisningsområdet klickar du på "Bkg" i rutan märkt "Detekteringströskel". Använd tröskelvärdesjusteringsfältet för att ange pixelidentifieringströskeln. När lämpligt pixelidentifieringströskel är markerat klickar du på "Använd på grupp".
       OBS:Detta protokoll fastställer detektionströskeln till 13 i svart läge för zebrafiskobservationer och vid 110 i transparent läge för observationer av fathead minnow.
   11. I rutan märkt "Rörelsetröskel" anger du önskade parametrar för rörelsehastighetsspårning. När hastighetsparametrarna har angetts klickar du på "Använd på grupp".
       OBS:Detta protokoll ställer in små/stora rörelser vid 20 mm/s och inaktiva/små rörelser vid 5 mm/s. Dessa val programmerar programvaran för att spåra larvfiskrörelser vid tre olika hastighetsnivåer: inaktiv (frysning) = <5 mm/s, liten (cruising) = 5–20 mm/s och stor (sprängning) = >20 mm/s.
   12. Klicka på "Parametrar | Protokollparametrar" från rullgardinsmenyn. Välj fliken "Tid" i dialogrutan. Ange observationstid och integrationstid. När parametrar har angetts klickar du på "Ok".
   13. Om du vill ställa in ljus/mörka fotoperiodstider och ljusintensitet för varje fotoperiod öppnar du dialogrutan för drivrutinsinställningar genom att välja "Lätt körning" på rullgardinsmenyn "Parametrar".
       OBS:Se protokollvideo för att ställa in flera ljus-mörka fotoperioder.
   14. När videospårningsparametrarna har angetts sparar du observationsprotokollet.
       OBS:Detta protokoll observerar fiskbeteende under en 50-min period som inkluderar en 10 min acklimatiseringsfas följt av 4 altererande ljusa / mörka faser bestående av två 10 minuters ljusperioder och två 10 min mörka perioder. Integrationstiden är inställd på att mäta beteendet för varje minut av beteendestudien på 50 minuter.

2. Observation av larvfisk lokomotoriskt och fotomotoriskt beteende

1. Placera brunnsplattan som innehåller experimentell fisk i beteenderegistreringskammaren.
2. Öppna spårningsprotokollet som utvecklats i nästa steg i videospårningsprogrammet.
3. I videospårningsvisaren kontrollerar du att alla larver är synliga på datorskärmen, att endast en enskild larva finns i varje brunn och att enskilda brunnar är i linje inom observationsområdena som definierades i steg 1.1.5 och 1.1.6.
4. Klicka på "Experimentera | Verkställ".
   OBS:Systemet uppmanar användaren att ange ett namn och en plats för att spara observationsdata.
5. När namnet och spara platsen för observationsdata har angetts klickar du på ikonen "Flera livebilder" för att markera alla fördefinierade visningsområden
   Obs:Den här ikonen finns högst upp på datorskärmen och visas som en ruta uppdelad i fyra mindre rutor. Om du klickar på den här ikonen markeras alla fördefinierade visningsområden.
6. Stäng panelen i inspelningskammaren och klicka på "Bakgrund | Start" på datorskärmen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers