Photomotor Response Assay: Eine Methode, um die Verhaltensreaktion von Larval Zebrafish auf eine plötzliche Änderung des Beleuchtungszustands zu messen

Overview

Dieses Video beschreibt den photomotorischen Antworttest von Zebrafischen und Fettkopf-Minnow-Larven mit einer automatisierten Tracking-Software. Das Protokoll misst die Verhaltensreaktion der Larvenfische nach einer plötzlichen Änderung des Beleuchtungszustands.

Protocol

1. Kalibrierung von Video-Tracking-Parametern

1. Legen Sie vor Verhaltensmessungen Beobachtungs- und Kalibrierparameter in der Videospursoftware fest (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Legen Sie eine Brunnenplatte in die Aufnahmekammer mit mindestens 1 Larvenfisch in einen einzelnen Brunnen. Verwenden Sie die Platte und die zugehörigen Fische als Darstellungen, um Kalibrierungsparameter festzulegen.
   2. Klicken Sie in der Videospur-Software auf "Datei | Generieren Sie Protokoll", das ein Dialogfeld "Protokollerstellungsassistent" öffnet. Geben Sie im Feld "Standortzählung" die Anzahl der Personenbrunnen der Brunnenplatte ein und klicken Sie dann auf "OK".
   3. Klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf "| anzeigen Vollbild", was das System auffordert, eine Overhead-Kameraansicht der Wellplatte anzuzeigen.
   4. Klicken Sie auf das Symbol "Bereiche zeichnen", das als drei mehrfarbige Formen angezeigt wird. Wählen Sie rechts vom Gutplatten-Betrachtungsbereich das Kreissymbol im Feld mit der Bezeichnung "Bereiche" aus.
   5. Verwenden Sie den Cursor, um den kreisförmigen Video-Tracking-Bereich im oberen linken Brunnen der Brunnenplatte abzurunden. Wählen Sie "Rechtsoben Markierung" und skizzieren Sie dann den Betrachtungsbereich oben rechts gut. Wählen Sie dann "Untere Markierung", um die untere rechte Seite gut zu umreißen.
      ANMERKUNG: Nach dem Zeichnen des kreisförmigen Umrisses muss seine Position wahrscheinlich angepasst werden.  Um die Position der Gliederung anzupassen, klicken Sie auf "auswählen" und verwenden Sie dann den Cursor, um den umrissenen Bereich zu verschieben. Außerdem können Umrisse repliziert werden, indem Sie auf "Kopieren" und dann auf "Einfügen" klicken.
   6. Nachdem die oberen linken, oberen rechten und unteren rechten Gut-Tracking-Bereiche definiert wurden, klicken Sie auf "Build", um die Software aufzufordern, die Anzeigebereiche der verbleibenden Brunnen automatisch zu definieren.
   7. Klicken Sie im Bereich "Kalibrierung" auf "Skalen zeichnen". Verwenden Sie den Cursor, um eine horizontale Linie über die Platte zu zeichnen. Sobald die Linie gezeichnet ist, erscheint ein Dialogfeld mit der Bezeichnung "Kalibrierungsmessung". Geben Sie die Well-Plattenlänge ein und klicken Sie auf "OK".
   8. Beenden Sie den Zeichnungs-Manager, indem Sie auf das Symbol "Bereiche zeichnen" klicken.
   9. Klicken Sie auf das Symbol "Kacheln".  Markieren Sie mit dem Cursor alle Felder, die auf dem Anzeigebildschirm angezeigt werden, sodass jedes Feld grün ist.
      HINWEIS: Das Kachelsymbol wird als Gruppe von sechs einzelnen kleinen Quadraten angezeigt
   10. "Klicken Sie auf Ansicht| Vollbild".  Klicken Sie rechts neben dem Plattenanzeigebereich auf "Bkg" in das Feld mit der Bezeichnung "Erkennungsschwelle". Verwenden Sie die Schwellenwertanpassungsleiste, um den Schwellenwert für die Pixelerkennung festzulegen. Sobald der entsprechende Schwellenwert für die Pixelerkennung ausgewählt ist, klicken Sie auf "Auf Gruppe anwenden".
       ANMERKUNG: Dieses Protokoll legt den Erkennungsschwellenwert im Schwarzmodus für Zebrafischbeobachtungen auf 13 und im transparenten Modus für Fathead-Minnow-Beobachtungen auf 110 fest.
   11. Geben Sie in dem Feld mit der Bezeichnung "Bewegungsschwelle" die gewünschten Bewegungsgeschwindigkeitsverfolgungsparameter ein. Sobald Geschwindigkeitsparameter festgelegt sind, klicken Sie auf "Auf Gruppe anwenden".
       ANMERKUNG: Dieses Protokoll legt kleine/große Bewegungen auf 20 mm/s und inaktive/kleine Bewegungen bei 5 mm/s fest. Diese Auswahlprogramme programmieren die Software, um die Bewegung von Larvenfischen bei drei verschiedenen Geschwindigkeitsstufen zu verfolgen: inaktiv (Gefrieren) = <5 mm/s, klein (Cruising) = 5–20 mm/s und groß (bursting) = >20 mm/s.
   12. Klicken Sie auf "Parameter | Protokollparameter" aus dem Dropdown-Menü. Wählen Sie im Dialogfeld die Registerkarte "Zeit". Geben Sie die Beobachtungszeit und die Integrationszeit ein. Nachdem die Parameter eingegeben wurden, klicken Sie auf "Ok".
   13. Um die Hellen/Dunkel-Photoperiodenzeiten und die Lichtintensität für jede Photoperiode einzustellen, öffnen Sie die Dialogbox für die Lichttreibereinstellungen, indem Sie im Dropdown-Menü "Parameter" "Light Driving" auswählen.
       HINWEIS: Siehe Protokollvideo zum Festlegen mehrerer hell-dunkler Fotoperioden.
   14. Nachdem die Video-Tracking-Parameter eingestellt wurden, speichern Sie das Beobachtungsprotokoll.
       HINWEIS: Dieses Protokoll beobachtet das Fischverhalten über einen Zeitraum von 50 min, der eine 10 min Akklimatisierungsphase umfasst, gefolgt von 4 sich verändernden hellen/dunklen Phasen, die aus zwei 10 min Hellenperioden und zwei 10 min dunklen Perioden bestehen. Die Integrationszeit wird festgelegt, um das Verhalten für jede Minute der 50 minuten-Verhaltensstudie zu messen.

2. Beobachtung des Larval Fish Locomotor und Photomotor Verhaltens

1. Legen Sie die Brunnenplatte mit experimentellen Fischen in die Verhaltensaufnahmekammer.
2. Öffnen Sie in der Video-Tracking-Software das im nächsten Schritt entwickelte Tracking-Protokoll.
3. Stellen Sie im Video-Tracking-Viewer sicher, dass alle Larven auf dem Computerbildschirm sichtbar sind, dass in jedem Brunnen nur eine einzelne Larve vorhanden ist und dass einzelne Brunnen innerhalb der Beobachtungsbereiche ausgerichtet sind, die in den Schritten 1.1.5 und 1.1.6 definiert wurden.
4. Klicken Sie auf "Experiment | Execute".
   HINWEIS: Das System fordert den Benutzer auf, einen Namen und einen Speicherort zum Speichern der Beobachtungsdaten bereitzustellen.
5. Sobald der Name und die Speicherortposition der Beobachtungsdaten angegeben wurden, klicken Sie auf das Symbol "Mehrere Live-Bilder", um alle vordefinierten Anzeigebereiche hervorzuheben.
   HINWEIS: Dieses Symbol befindet sich oben auf dem Computerbildschirm und wird als Feld angezeigt, das in vier kleinere Quadrate unterteilt ist. Wenn Sie auf dieses Symbol klicken, werden alle vordefinierten Anzeigebereiche hervorgehoben.
6. Schließen Sie das Bedienfeld der Aufnahmekammer und klicken Sie auf "Hintergrund | Start" auf dem Computermonitor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers