光动器响应分析：测量拉瓦尔斑马鱼对照明条件突然变化的行为反应的方法

Overview

此视频使用自动跟踪软件描述了斑马鱼和肥头小幼虫的光动器响应检测。该协议测量幼鱼在照明条件突然变化后的行为反应。

Protocol

1. 视频跟踪参数校准

1. 在行为测量之前，在视频跟踪软件中设置观察和校准参数（参见材料表）。
   1. 在录音室中放置一个井板，在单独的井中至少放1条幼鱼。使用板和相关鱼作为表示来设置校准参数。
   2. 在视频跟踪软件中，单击"文件|生成协议"，这将打开一个"协议创建向导"对话框。在"位置计数"字段中，输入井板的个体井数，然后单击"OK"。
   3. 在屏幕顶部，单击"查看|全屏"，这将提示系统显示井板的头顶摄像头视图。
   4. 单击"绘制区域"图标，该图标显示为三个五颜六色的形状。在井板查看区域的右侧，选择标有"区域"的字段中的圆图标。
   5. 使用光标来描述井板左上井的圆形视频跟踪区域。选择"右上角标记"，然后勾勒出右上角的查看区域。然后，选择"底部标记"来勾勒出右下角的轮廓。
      注：绘制圆形轮廓后，其位置可能需要调整。 要调整轮廓的位置，请单击"选择"，然后使用光标移动轮廓区域。此外，轮廓可以通过单击"复制"然后"粘贴"进行复制。
   6. 定义左上、右上和右下井跟踪区域后，单击"构建"以提示软件自动划定剩余油井的查看区域。
   7. 在标有"校准"的区域中，单击"绘制比例"。使用光标在板上画一条水平线。划线后，将显示一个标有"校准测量"的对话框。输入井板长度，然后单击"确定"。
   8. 单击"绘图区域"图标退出绘图管理器。
   9. 单击"瓷砖"图标。 使用光标，突出显示显示屏幕上显示的所有框，使每个框为绿色。
      注： 瓷砖图标显示为六个单独的小正方形组
   10. "单击视图|全屏"。 在板查看区域的右侧，单击标有"检测阈值"的框中的"Bkg"。使用阈值调整条设置像素检测阈值。一旦选择适当的像素检测阈值，请单击"应用到组"。
       注意：此协议将斑马鱼观测的检测阈值设置为黑色模式的 13，在透明模式下设置为 110，用于脂肪头小鱼观测。
   11. 在标有"运动阈值"的框中，输入所需的移动速度跟踪参数。设置速度参数后，单击"应用到组"。
       注意：此协议将小/大运动设置为 20 mm/s，非活动/小运动设置为 5 mm/s。这些选择程序的软件跟踪幼鱼运动在三个不同的速度水平：非活动（冻结） = lt;5毫米/s，小（巡航） = 5×20毫米/s，大（爆裂） = + 20毫米/s。
   12. 单击"参数|从下拉菜单中的"协议参数"。在对话框中，选择"时间"选项卡。输入观察时间和集成时间。输入参数后，单击"确定"。
   13. 通过从"参数"下拉菜单中选择"光驱动"，为每个照片设置光驱程序设置对话框，为每个照片设置光/暗光时间和光强度。
       注意：请参阅协议视频，了解设置多个浅暗光片。
   14. 设置视频跟踪参数后，保存观察协议。
       注意：本协议观察鱼的行为在50分钟期间，其中包括一个10分钟的适应阶段，然后是4个改变光/暗相，包括两个10分钟的光周期和两个10分钟的黑暗周期。集成时间设置为测量 50 分钟行为试验中每分钟的行为。

2. 观察拉瓦尔鱼运动和光运动行为

1. 将含有实验鱼的井板放在行为记录室中。
2. 在视频跟踪软件中，打开下一步开发的跟踪协议。
3. 在视频跟踪查看器中，检查以确保所有幼虫在计算机屏幕上可见，每口井中只存在一个单独的幼虫，并且单个油井在步骤 1.1.5 和 1.1.6 定义的观测区域内对齐。
4. 点击"实验|执行"。
   注：系统将提示用户提供姓名和位置以保存观测数据。
5. 指定观察数据的名称和保存位置后，单击"多个实时图像"图标以突出显示所有预先定义的查看区域
   注意：此图标位于计算机屏幕顶部，以一个盒子的身份出现，分为四个较小的正方形。单击此图标将突出显示所有预先定义的查看区域。
6. 关闭录音室的面板，然后单击"背景|在计算机监视器上启动"。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers