फोटोमोटर रिस्पांस परख: प्रकाश की स्थिति में अचानक परिवर्तन के लिए लार्वा ज़ेब्राफ़िश के व्यवहार प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो एक स्वचालित ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके जेब्राफिश और फैटहेड मिनो लार्वा की फोटोमोटर प्रतिक्रिया परख का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल प्रकाश की स्थिति में अचानक परिवर्तन के बाद लार्वा मछली की व्यवहार प्रतिक्रिया को मापता है।

Protocol

1. वीडियो ट्रैकिंग मापदंडों का अंशांकन

1. व्यवहार उपायों से पहले, वीडियो ट्रैक सॉफ्टवेयर में अवलोकन और अंशांकन पैरामीटर सेट करें (सामग्री की तालिका देखें)।
   1. एक व्यक्ति में कम से कम 1 लार्वा मछली के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष में एक अच्छी तरह से प्लेट रखें। अंशांकन मापदंडों को निर्धारित करने के लिए अभ्यावेदन के रूप में प्लेट और संबद्ध मछली का उपयोग करें।
   2. वीडियो ट्रैक सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "फाइल | प्रोटोकॉल उत्पन्न करें, जो "प्रोटोकॉल निर्माण जादूगर" संवाद बॉक्स खोलेगा। "स्थान गणना" क्षेत्र में, अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तियों के कुओं की संख्या दर्ज करें और फिर "ठीक" पर क्लिक करें।
   3. स्क्रीन के शीर्ष पर, क्लिक करें "देखें | फुल स्क्रीन", जो सिस्टम को अच्छी तरह से प्लेट के ओवरहेड कैमरा व्यू को प्रदर्शित करने का संकेत देगा।
   4. "ड्रा क्षेत्र" आइकन पर क्लिक करें, जो तीन बहुरंगी आकृतियों के रूप में दिखाई देता है। अच्छी तरह से प्लेट देखने के क्षेत्र के दाईं ओर, "क्षेत्र" लेबल वाले क्षेत्र में सर्कल आइकन का चयन करें।
   5. अच्छी तरह से प्लेट के ऊपर छोड़ दिया अच्छी तरह से परिपत्र वीडियो ट्रैकिंग क्षेत्र को चित्रित करने के लिए कर्सर का उपयोग करें। "टॉप-राइट मार्क" का चयन करें और फिर शीर्ष के देखने के क्षेत्र को अच्छी तरह से रेखांकित करें। फिर, नीचे सही अच्छी तरह से रूपरेखा के लिए "नीचे मार्क" का चयन करें ।
      नोट:परिपत्र रूपरेखा ड्राइंग के बाद, इसकी स्थिति को समायोजित करने की आवश्यकता होगी ।  रूपरेखा की स्थिति को समायोजित करने के लिए, "चुनें" पर क्लिक करें और फिर उल्लिखित क्षेत्र को स्थानांतरित करने के लिए कर्सर का उपयोग करें। इसके अलावा,"कॉपी"और फिर"पेस्ट"पर क्लिक करके रूपरेखा दोहराई जा सकती है।
   6. ऊपर बाएं, ऊपर दाएं, और नीचे सही अच्छी तरह से ट्रैकिंग क्षेत्रों को परिभाषित किया गया है, शेष कुओं के देखने के क्षेत्रों को स्वचालित रूप से चित्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से चित्रित करने के लिए "बिल्ड" पर क्लिक करें।
   7. "अंशांकन" लेबल वाले क्षेत्र में, "ड्रा स्केल" पर क्लिक करें। थाली में एक क्षैतिज रेखा खींचने के लिए कर्सर का उपयोग करें। एक बार लाइन तैयार होने के बाद, "अंशांकन माप" लेबल वाला एक संवाद बॉक्स दिखाई देगा। अच्छी तरह से प्लेट की लंबाई दर्ज करें और "ठीक" पर क्लिक करें।
   8. "ड्रा क्षेत्र" आइकन पर क्लिक करके ड्राइंग मैनेजर से बाहर निकलें।
   9. "टाइल्स" आइकन पर क्लिक करें।  कर्सर का उपयोग करके, देखने वाली स्क्रीन पर दिखाई देने वाले सभी बक्से को हाइलाइट करें ताकि प्रत्येक बॉक्स हरा हो।
      नोट:टाइल्स आइकन छह व्यक्तिगत छोटे वर्गों के एक समूह के रूप में प्रकट होता है
   10. "क्लिक करें देखें| फुल स्क्रीन "।  प्लेट देखने के क्षेत्र के दाईं ओर, "डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड" लेबल वाले बॉक्स में "बीकेजी" पर क्लिक करें। पिक्सेल डिटेक्शन सीमा सेट करने के लिए थ्रेसहोल्ड एडजस्टमेंट बार का उपयोग करें. एक बार, उपयुक्त पिक्सेल डिटेक्शन सीमा का चयन हो जाने के बाद, "समूह पर लागू करें" पर क्लिक करें।
       नोट:यह प्रोटोकॉल जेब्राफिश टिप्पणियों के लिए ब्लैक मोड में 13 पर और फैटहेड मिनो टिप्पणियों के लिए पारदर्शी मोड में 110 पर पता लगाने की सीमा निर्धारित करता है।
   11. "आंदोलन सीमा" लेबल वाले बॉक्स में, वांछित आंदोलन गति ट्रैकिंग मापदंडों में प्रवेश करें। एक बार स्पीड पैरामीटर सेट हो जाने के बाद,"ग्रुप पर लागू करें" पर क्लिक करें।
       नोट-यह प्रोटोकॉल 20 मिमी/एस पर छोटे/बड़े आंदोलनों को सेट करता है और निष्क्रिय/छोटे आंदोलनों को 5 मिमी/s पर सेट करता है । ये चयन तीन अलग-अलग गति स्तरों पर लार्वा मछली आंदोलन को ट्रैक करने के लिए सॉफ्टवेयर प्रोग्राम करते हैं: निष्क्रिय (ठंड) = और एलटी;5 मिमी/एस, छोटे (मंडरा) = 5-20 मिमी/एस, और बड़े (फोड़) = & 20 मिमी/
   12. क्लिक करें "पैरामीटर | ड्रॉप-डाउन मेनू से प्रोटोकॉल पैरामीटर"। संवाद बॉक्स में, "समय" टैब का चयन करें। अवलोकन समय और एकीकरण समय दर्ज करें। मापदंडों के बाद क्लिक करें "ठीक है" दर्ज कर रहे हैं।
   13. प्रत्येक फोटोपीरियोड के लिए प्रकाश/डार्क फोटोपीरियोड समय और प्रकाश तीव्रता सेट करने के लिए "पैरामीटर" ड्रॉप डाउन मेनू से "लाइट ड्राइविंग" का चयन करके लाइट ड्राइवर सेटिंग्स डायलॉग बॉक्स खोलें।
       नोट:कई हल्के-अंधेरे फोटोपीरियोड सेट करने के लिए प्रोटोकॉल वीडियो देखें।
   14. वीडियो ट्रैकिंग पैरामीटर सेट होने के बाद ऑब्जर्वेशन प्रोटोकॉल को सेव करें।
       नोट:यह प्रोटोकॉल एक ५० मिनट की अवधि में मछली के व्यवहार का पालन करता है जिसमें 10 मिनट का अभिनंदन चरण शामिल है जिसके बाद 4 फेरबदल प्रकाश/अंधेरे चरणों में दो 10 मिनट प्रकाश अवधि और दो 10 मिनट अंधेरे अवधि शामिल हैं । एकीकरण समय 50 मिनट व्यवहार परीक्षण के प्रत्येक मिनट के लिए व्यवहार को मापने के लिए सेट है।

2. लार्वा मछली लोकोमोटर और फोटोमोटर व्यवहार का अवलोकन

1. व्यवहार रिकॉर्डिंग कक्ष में प्रयोगात्मक मछली युक्त अच्छी तरह से थाली रखें।
2. वीडियो ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर में, अगले चरण में विकसित ट्रैकिंग प्रोटोकॉल खोलें।
3. वीडियो ट्रैकिंग दर्शक में, यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि कंप्यूटर स्क्रीन पर सभी लार्वा दिखाई दे रहे हैं, कि प्रत्येक कुएं में केवल एक व्यक्तिगत लार्वा मौजूद है, और व्यक्तिगत कुओं को अवलोकन क्षेत्रों के भीतर गठबंधन किया जाता है जिन्हें चरण 1.1.5 और 1.1.6 में परिभाषित किया गया था।
4. "प्रयोग | पर क्लिक करें निष्पादित करें"।
   नोट:सिस्टम उपयोगकर्ता को अवलोकन डेटा को सहेजने के लिए एक नाम और स्थान प्रदान करने का संकेत देगा।
5. एक बार अवलोकन डेटा का नाम और सेव स्थान निर्दिष्ट हो जाने के बाद, सभी पूर्व-परिभाषित देखने वाले क्षेत्रों को हाइलाइट करने के लिए "कई लाइव इमेजेज" आइकन पर क्लिक करें
   नोट:यह आइकन कंप्यूटर स्क्रीन के शीर्ष पर स्थित है और चार छोटे वर्गों में विभाजित बॉक्स के रूप में दिखाई देता है। इस आइकन पर क्लिक करने से सभी पूर्व-परिभाषित देखने वाले क्षेत्रों को हाइलाइट किया जाएगा।
6. रिकॉर्डिंग कक्ष के पैनल को बंद करें और "बैकग्राउंड |" पर क्लिक करें कंप्यूटर मॉनिटर पर "शुरू करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
48-well plates	Fisher Scientific	08-772-52	Larval zebrafish behavioral recording chambers
24-well plates	VWR	10062-896	Larval fathead minnow behavioral recording chambers