Overview
Denne videoen beskriver byttefangstanalysen. Videoen diskuterer metoden for å studere byttedyr fange oppførsel av sebrafisk larver etter laser ablasjon av spesifikke nevroner.
Protocol
1. Vurdering av atferdsmessige konsekvenser etter laser ablasjon
- Sett opp et atferdsopptakssystem som består av et stereoskop utstyrt med et videokamera. Bruk et kamera med riktig programvare for bildeanskaffelse, kommersiell eller skreddersydd (figur 1A).
- Optimaliser lysforholdene slik at parameciumet kan oppdages ved bildebehandling. Du kan for eksempel bruke et hvitt led-lampe for ring med avstandsstykke (figur 1B).
Merk: Avstanden fra, og vinkelen på, LED-lampen påvirker utseendet på prøven (dvs., lys i mørk bakgrunn eller mørk i lys bakgrunn) og er derfor kritisk for vellykket bildebehandling. Bestem den beste høyden på avstandsstykket (figur 1C). - Plasser en sebrafisklarve (gjenvunnet fra laser-ablasjonseksperimentet beskrevet i avsnitt 1) i et atferdsopptakskammer (som var festet til et glasssklie) med den originale topptetningen fjernet (Figur 1D).
- Samle 50 paramecia suspendert i vann fra begeret ved hjelp av en mikropipette og plasser dem i opptakskammeret.
- Plasser en dekselslipp på toppen av opptakskammeret. Sett en liten dråpe vann på dekselslippet før du plasserer på vannoverflaten til opptakskammeret for å unngå å introdusere luft i kammeret.
Merk: I dette trinnet vil noe vann med paramecia overløpe fra opptakskammeret. Det resterende antallet paramecia i opptakskammeret vil være ca. 30-40. - Plasser opptakskammeret (som inneholder en larve og paramecia) i belysningssystemet (Figur 1D).
- Start tidsforløpopptaket med 10 bps i 11 minutter (6600 bilder).
- (Valgfritt) For hver larve som ble testet for atferd, observere fluorescensen av laser-ablated områdene ved fluorescerende mikroskopi for å bekrefte effektiviteten av laser-ablasjon (dvs.fravær, eller betydelig redusert antall fluorescerende celler i det laserbestrålede området).
Merk: Selv etter bestråling kan noen fluorescerende celler fortsatt observeres på grunn av senere utbrudd av Gal4-genuttrykk i celler som differensieres etter ablasjon. - Etter å ha registrert larvens oppførsel, for å kompensere for mangelen på ensartethet i bakgrunnen, utfør en piksel-for-piksel-deling av hvert bilde med et gjennomsnittlig bilde i Fiji: klikk 'Prosess', 'Bildekalkulator', 'Operasjon: Split', '32-bit(float)result', og 'OK'. Hvis du vil lage et gjennomsnittlig bilde, klikker du Bilde, Stakker, Z-prosjekt, Gjennomsnittlig intensitet og OK (Figur 1E, F).
- Tell antall paramecia som er igjen i kammeret ved å klikke på 'Analyser', 'Analyser partikler', angi et områdeområde som dekker hele paramecia, merke av for 'Vis:masker' og klikke 'OK'. Alternativet Vis:masker gir et ekstrahert parameciabilde (figur 1G), med en liste over antall partikler (paramecia) i hvert delbilde.
- Plott antall paramecia igjen i opptakskammeret over tid. Fordi anslagene for antall paramecia er støyende, anbefaler vi at du utfører et glidende gjennomsnitt på hvert punkt i et område på 600 bilder (1 min) i regnearket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Prey fange analyse og representative data i laser-ablated sebrafisk larver. (A) Virkemåte opptakssystem. Stereomikroskopet var utstyrt med et CMOS-kamera. Bilder ble anskaffet ved hjelp av et skreddersydd skript. (B) Komponenter i belysningssystemet. Et grått farget papir, en glassdiffusor, hvitt LED-ringlys, diffusor, en skreddersydd avstandsstykke (papp) og diffusor med hull i midten. (C) Belysningssystemet som er montert fra delene som er vist i B. (D) Opptakskammer for byttefangstanalysen. Et kammer (diameter: 20 mm; dybde: 2,5 mm) ble plassert på en glasssklie. Den opprinnelige toppforseglingen av kammeret ble skrelt av. Et glassdeksel ble satt på opptakskammeret. (E) Rå bilde fra en ramme av den innspilte filmen. (F) Et delbilde delt (piksel for piksel) på et gjennomsnittlig bilde i en film. Vær oppmerksom på at den ikke-ensartede bakgrunnen i belysningen kan kompenseres av denne bildebehandlingen. (G) Paramecia hentet fra en ramme ved hjelp av "Partikkelanalyse" -funksjonen i Fiji. (H) Eksempel på bilde i Fiji med en brukt terskelverdi. Paramecia ser lyse ut, mens sebrafisk larvens øyne ser mørke ut, og bakgrunnen er grå. Endringer i øyeposisjoner (dvs., vinkler med hensyn til kroppsaksen) kan beregnes om nødvendig. (I) Representative eksperimentelle data om parameciumforbruk i en olfaktorisk-pære-ablated kontroll larve (OB) og en pretectum-ablated larve (PT). Pretectum ablasjon betydelig redusert byttedyr jakt evne mens olfaktorisk pære ablasjon ikke påvirket det.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Model:C11440-22CU | A scientific CMOS camera |
| SZX7 | Olympus | Stereoscope | |
| A ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
