Prey Capture Assay: een methode om het prooivangstgedrag van zebravislarven te bestuderen

Overview

Deze video beschrijft de prooivangsttest. De video bespreekt de methode om het vangstgedrag van prooidieren van zebravislarven te bestuderen na de laserablatie van specifieke neuronen.

Protocol

1. Beoordeling van gedragsgevolgen na laserablatie

1. Stel een gedragsopnamesysteem in dat bestaat uit een stereoscope die is uitgerust met een videocamera. Gebruik een camera met de juiste beeldverwervingssoftware, commercieel of op maat gemaakt (figuur 1A).
2. Optimaliseer de lichtconditie zodat het paramecium kan worden gedetecteerd door beeldverwerking. Gebruik bijvoorbeeld een ringwit LED-lampje met een afstandsbalk (Afbeelding 1B).
   Opmerking: De afstand tot en de hoek van de LED beïnvloedt het uiterlijk van het monster(d.w.z.helder op een donkere achtergrond of donker op een heldere achtergrond) en is daarom van cruciaal belang voor een succesvolle beeldverwerking. Bepaal de beste hoogte van de afstandsbalk (figuur 1C).
3. Plaats een zebravislarve (teruggevonden uit het laserablatie-experiment beschreven in sectie 1) in een gedragsopnamekamer (die aan een glazen glijbaan was bevestigd) met de originele bovenafdichting verwijderd (figuur 1D).
4. Verzamel 50 paramecia opgehangen in water uit het bekerglas met behulp van een micropipet en plaats ze in de opnamekamer.
5. Plaats een hoesje op de opnamekamer. Plaats een kleine druppel water op de afdekslip voordat u deze op het wateroppervlak van de opnamekamer plaatst om te voorkomen dat er lucht in de kamer komt.
   Opmerking: In deze stap zal wat water met paramecia uit de opnamekamer overlopen. Het resterende aantal paramecia in de opnamekamer zal ongeveer 30-40 zijn.
6. Plaats de opnamekamer (met een larve en paramecia) in het verlichtingssysteem (figuur 1D).
7. Start de time-lapse opname met 10 fps gedurende 11 min (6.600 frames).
8. (Optioneel) Voor elke larve die is getest op gedrag, observeer de fluorescentie van de laser-ablated gebieden door fluorescerende microscopie om de effectiviteit van de laserablatie te bevestigen(d.w.z.afwezigheid, of aanzienlijk verminderd aantal fluorescerende cellen in het laser-bestraalde gebied).
   Opmerking: Zelfs na bestraling kunnen sommige fluorescerende cellen nog steeds worden waargenomen als gevolg van het latere begin van Gal4-genexpressie in cellen die zich na ablatie onderscheidden.
9. Na het registreren van het gedrag van de larve, om het gebrek aan uniformiteit op de achtergrond te compenseren, voert u een pixel-voor-pixel-verdeling van elk frame uit door een gemiddelde afbeelding in Fiji: klik op 'Proces', 'Beeldcalculator', 'Operatie: Delen', '32-bits (float)resultaat' en 'OK'. Om een gemiddelde afbeelding te maken, klikt u op 'Afbeelding', 'Stapels', 'Z-Project', 'Gemiddelde intensiteit' en 'OK' (Figuur 1E, F).
10. Tel het aantal paramecia dat in de kamer achterbleef door te klikken op 'Analyseren', 'Deeltjes analyseren', een gebiedsbereik in te stellen dat alle parameciabedekt, het selectievakje 'Toon:Maskers' aan te vinken en op 'OK' te klikken. De optie 'Toon:Maskers' geeft een geëxtraheerde paramecia-afbeelding (figuur 1G), met een lijst van het aantal deeltjes (paramecia) in elk frame.
11. Plot het aantal paramecia dat in de loop van de tijd in de opnamekamer is achtergelaten. Omdat de schattingen van het aantal paramecia luidruchtig zijn, raden we aan om op elk punt een voortschrijdend gemiddelde uit te voeren in een bereik van 600 frames (1 min) op de spreadsheet.

Representative Results

Figuur 1. Prooien vangen assay en representatieve gegevens in laser-ablated zebravislarven. (A) Gedragsregistratiesysteem. De stereomicroscoop was uitgerust met een CMOS camera. Afbeeldingen zijn verkregen met behulp van een op maat gemaakt script. (B) Onderdelen van het verlichtingssysteem. Een grijs gekleurd papier, een glazen diffuser, witte LED-ringlamp, diffuser, een op maat gemaakte afstandsstuk (karton) en diffuser met een gat in het midden. (C) Het verlichtingssysteem gemonteerd uit de onderdelen in B. (D) Opnamekamer voor de prooivangsttest. Een kamer (diameter: 20 mm; diepte: 2,5 mm) werd op een glazen glijbaan geplaatst. De originele bovenafdichting van de kamer werd afgepeld. Er werd een glazen hoes op de opnamekamer gelegd. (E) Raw-afbeelding uit een frame van de opgenomen film. (F) Een frame gedeeld (pixel-voor-pixel) door een gemiddelde afbeelding in een film. Merk op dat de niet-uniforme achtergrond in de belichting kan worden gecompenseerd door deze beeldverwerking. (G) Paramecia geëxtraheerd uit een frame met behulp van de functie "Deeltjesanalyse" in Fiji. (H) Voorbeeld van afbeelding in Fiji met een toegepaste drempelwaarde. Paramecia lijken helder, terwijl de ogen van de zebravislarve donker lijken en de achtergrond grijs is. Veranderingen in oogposities(d.w.z.hoeken ten opzichte van de lichaamsas) kunnen indien nodig worden berekend. (I) Representatieve experimentele gegevens over het parameciumverbruik in een reukbol-ablated controlelarve (OB) en een pretectum-ablated larve (PT). Pretectumablatie verminderde het jachtvermogen van prooien aanzienlijk, terwijl olfactorische bolablatie er geen invloed op had.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging