Overview
यह वीडियो शिकार पर कब्जा परख का वर्णन करता है । वीडियो विशिष्ट न्यूरॉन्स के लेजर एब्लेशन के बाद जेब्राफिश लार्वा के शिकार कैप्चर व्यवहार का अध्ययन करने की विधि पर चर्चा करता है।
Protocol
1. लेजर एब्लेशन के बाद व्यवहार परिणामों का आकलन
- एक व्यवहार रिकॉर्डिंग प्रणाली स्थापित करें जिसमें वीडियो कैमरे से लैस स्टीरियोस्कोप होता है। एक उपयुक्त छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, वाणिज्यिक या कस्टम-मेड(चित्रा 1A) केसाथ एक कैमरे का उपयोग करें।
- प्रकाश की स्थिति को अनुकूलित करें ताकि इमेज प्रोसेसिंग द्वारा पैरामेनियम का पता लगाया जा सके। उदाहरण के लिए, एक स्पेसर(चित्रा 1B)के साथ एक रिंग व्हाइट एलईडी लाइट का उपयोग करें।
नोट: से दूरी, और के कोण, एलईडी नमूने की उपस्थिति को प्रभावित करताहै (यानी,अंधेरे पृष्ठभूमि में उज्ज्वल या उज्ज्वल पृष्ठभूमि में अंधेरे) और इसलिए, सफल छवि प्रसंस्करण के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्पेसर(चित्रा 1C)की सबसे अच्छी ऊंचाई निर्धारित करें। - एक ज़ेब्राफ़िश लार्वा (धारा 1 में वर्णित लेजर-एब्लेशन प्रयोग से बरामद) एक व्यवहार रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें (जो एक ग्लास स्लाइड से जुड़ा हुआ था) मूल शीर्ष सील के साथ हटा दिया गया(चित्रा 1D)।
- माइक्रोपिपेट का उपयोग करके बीकर से पानी में निलंबित 50 पैरासिया को इकट्ठा करें और उन्हें रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें।
- रिकॉर्डिंग चैंबर के ऊपर एक कवर स्लिप रखें। कक्ष में हवा शुरू करने से बचने के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष के पानी की सतह पर रखने से पहले कवर पर्ची पर पानी की एक छोटी सी बूंद रखो।
नोट: इस कदम में, परमेसिया के साथ कुछ पानी रिकॉर्डिंग कक्ष से ओवरफ्लो होगा। रिकॉर्डिंग चैंबर में परमेसिया की शेष संख्या लगभग 30-40 होगी। - लाइटिंग सिस्टम(चित्रा 1D)में रिकॉर्डिंग चैंबर (एक लार्वा और परमेसियायुक्त) रखें।
- 11 मिनट (6,600 फ्रेम) के लिए 10 एफपीएस पर समय-चूक रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- (वैकल्पिक) व्यवहार के लिए परीक्षण किए गए प्रत्येक लार्वा के लिए, लेजर-एब्लेशन(यानी,अनुपस्थिति, या लेजर-विकिरणित क्षेत्र में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या में काफी कमी) की प्रभावशीलता की पुष्टि करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा लेजर-एब्लेटेड क्षेत्रों की फ्लोरेसेसेंस का निरीक्षण करें।
नोट: विकिरण के बाद भी, कुछ फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को अभी भी कोशिकाओं में Gal4 जीन अभिव्यक्ति की बाद की शुरुआत के कारण देखा जा सकता है जो एब्लेशन के बाद विभेदित होते हैं। - लार्वा के व्यवहार को रिकॉर्ड करने के बाद, पृष्ठभूमि में एकरूपता की कमी की भरपाई के लिए, फिजी में एक औसत छवि द्वारा प्रत्येक फ्रेम के पिक्सेल-बाय-पिक्सेल डिवीजन का प्रदर्शन करें: 'प्रक्रिया', 'छवि कैलकुलेटर', 'ऑपरेशन: डिवाइड', '32-बिट (फ्लोट) परिणाम', और 'ओके'। एक औसत छवि बनाने के लिए, 'छवि', 'स्टैक', 'जेड-प्रोजेक्ट', 'औसत तीव्रता', और'ओके' (चित्रा 1E, एफ)पर क्लिक करें।
- 'विश्लेषण', 'विश्लेषण कणों' पर क्लिक करके कक्ष में छोड़े गए पैरासिया की संख्या गिनें, एक क्षेत्र सीमा निर्धारित करें जो सभी पैरासियाको कवर करती है, 'शो: मास्क' चेकबॉक्स की जांच करती है, और 'ओके' पर क्लिक करती है। 'शो: मास्क' विकल्प प्रत्येक फ्रेम में कणों (पैरासिया) की संख्या की एक सूची के साथ एक निकाले गएपैरामेसियाछवि(चित्रा 1G)प्रदान करेगा।
- समय के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर में छोड़ दिया परमेसिया की संख्या प्लॉट। क्योंकि पैरासिया की संख्या के अनुमान शोर कर रहे हैं, हम स्प्रेडशीट पर 600 फ्रेम (1 मिनट) की एक सीमा में प्रत्येक बिंदु पर एक चलती औसत प्रदर्शन की सलाह देते हैं।
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Representative Results
चित्रा 1. लेजर-एब्लेटेड जेब्राफिश लार्वा में शिकार कैप्चर परख और प्रतिनिधि डेटा। (A)व्यवहार रिकॉर्डिंग सिस्टम। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप को सीएमओ कैमरे से लैस किया गया था । चित्रों को कस्टम-निर्मित स्क्रिप्ट का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। (ख)प्रकाश व्यवस्था के घटक। एक ग्रे रंग का कागज, एक ग्लास विसारक, सफेद एलईडी रिंग लाइट, विसारक, एक कस्टम निर्मित स्पेसर (कार्डबोर्ड), और केंद्र में एक छेद के साथ विसारक। (ग)शिकार कैप्चर परख के लिए बी(डी)रिकॉर्डिंग चैंबर में दिखाए गए हिस्सों से इकट्ठा प्रकाश व्यवस्था । एक कक्ष (व्यास: 20 मिमी; गहराई: 2.5 मिमी) एक ग्लास स्लाइड पर रखा गया था। चैंबर की मूल शीर्ष मुहर खुली थी। रिकॉर्डिंग चैंबर पर शीशा-कवर लगा दिया गया। (ई)रिकॉर्डेड फिल्म के एक फ्रेम से कच्चे छवि । (F)एक फिल्म में एक औसत छवि द्वारा विभाजित फ्रेम (पिक्सेल-बाय-पिक्सेल) । ध्यान दें कि प्रकाश में गैर-समान पृष्ठभूमि को इस छवि प्रसंस्करण द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है। (जी)पैरासिया फिजी में "कण विश्लेषण" समारोह का उपयोग कर एक फ्रेम से निकाला । (H)एक लागू सीमा के साथ फिजी में छवि का उदाहरण। पैरासिया उज्ज्वल दिखाई देते हैं, जबकि जेब्राफिश लार्वा की आंखें अंधेरी दिखाई देती हैं, और पृष्ठभूमि ग्रे है। यदि आवश्यक हो तो आंखों की स्थिति(यानी,शरीर की धुरी के संबंध में कोण) में परिवर्तन की गणना की जा सकती है। (I)घ्राण-बल्ब-एब्लेटेड कंट्रोल लार्वा (ओबी) और प्रीटेक्टम-एब्लेटेड लार्वा (पीटी) में पैरामेनियम खपत के प्रतिनिधि प्रायोगिक आंकड़े। प्रीटेकम एब्लेशन ने शिकार की शिकार क्षमता को काफी कम कर दिया जबकि घ्राण बल्ब एब्लेशन ने इसे प्रभावित नहीं किया।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Model:C11440-22CU | A scientific CMOS camera |
| SZX7 | Olympus | Stereoscope | |
| A ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
