Ensaio de captura de presas: um método para estudar o comportamento de captura de presas da larva de zebrafish

Overview

Este vídeo descreve o ensaio de captura de presas. O vídeo discute o método para estudar o comportamento de captura de presas de larvas de zebrafish após a ablação a laser de neurônios específicos.

Protocol

1. Avaliação das Consequências Comportamentais Após a Ablação a Laser

1. Configure um sistema de gravação comportamental que consiste em um estereoscópio equipado com uma câmera de vídeo. Use uma câmera com um software de aquisição de imagem adequado, comercial ou personalizado(Figura 1A).
2. Otimize a condição de iluminação para que o paramecium possa ser detectado pelo processamento da imagem. Por exemplo, use uma luz LED branca de anel com um espaçador(Figura 1B).
   Nota: A distância e o ângulo do LED afetam a aparência da amostra (ou seja,brilhante em fundo escuro ou escuro em fundo brilhante) e são, portanto, críticos para o processamento bem-sucedido da imagem. Determine a melhor altura do espaçador(Figura 1C).
3. Coloque uma larva de zebrafish (recuperada do experimento de ablação a laser descrito na Seção 1) em uma câmara de gravação comportamental (que foi anexada a um slide de vidro) com o selo superior original removido(Figura 1D).
4. Colete 50 paramécia suspensas na água do béquer usando uma micropipette e coloque-as na câmara de gravação.
5. Coloque um deslizamento de cobertura em cima da câmara de gravação. Coloque uma pequena gota de água no deslizamento da tampa antes de colocar na superfície da água da câmara de gravação para evitar a introdução de ar na câmara.
   Nota: Nesta etapa, um pouco de água com paramécia vai transbordar da câmara de gravação. O número restante de paramécia na câmara de gravação será de aproximadamente 30-40.
6. Coloque a câmara de gravação (contendo larva e paramecia)no sistema de iluminação(Figura 1D).
7. Inicie a gravação de lapso de tempo a 10 fps por 11 min (6.600 quadros).
8. (Opcional) Para cada larva testada para comportamento, observe a fluorescência das áreas abladas a laser por microscopia fluorescente para confirmar a eficácia da ablação a laser (ou seja,ausência, ou número significativamente reduzido de células fluorescentes na área irradiada a laser).
   Nota: Mesmo após a irradiação, algumas células fluorescentes ainda podem ser observadas devido ao início posterior da expressão genética de Gal4 em células que se diferenciaram após a ablação.
9. Depois de registrar o comportamento da larva, para compensar a falta de uniformidade no fundo, realize uma divisão pixel a pixel de cada quadro por uma imagem média em Fiji: clique em 'Processo', 'Calculadora de Imagem', 'Operação: Divida', '32 bits (float)result) e 'OK'. Para fazer uma imagem média, clique em 'Imagem', 'Stacks', 'Z-Project', 'Intensidade média' e 'OK'(Figura 1E, F).
10. Conte o número de paramécia deixada na câmara clicando em 'Analisar', 'Analisar partículas', definindo uma faixa de área que cobre toda a paramécia,verificando a caixa de seleção 'Show:Masks' e clicando em 'OK'. A opção 'Show:Masks' fornecerá uma imagem de paramécia extraída(Figura 1G),com uma lista do número de partículas(paramecia)em cada quadro.
11. Plote o número de paramécia deixadas na câmara de gravação ao longo do tempo. Como as estimativas do número de paramecia são ruivas, recomendamos realizar uma média móvel em cada ponto em uma faixa de 600 quadros (1 min) na planilha.

Representative Results

Figura 1. Teste de captura de presas e dados representativos em larvas de zebrafish a laser. (A) Sistema de gravação comportamental. O estereóquio estava equipado com uma câmera CMOS. As imagens foram adquiridas usando um script personalizado. (B) Componentes do sistema de iluminação. Um papel de cor cinza, um difusor de vidro, luz branca de anel led, difusor, um espaçador personalizado (papelão) e difusor com um orifício no centro. (C) O sistema de iluminação montado a partir das peças mostradas em B. (D) Câmara de gravação para o ensaio de captura de presas. Uma câmara (diâmetro: 20 mm; profundidade: 2,5 mm) foi colocada em uma lâmina de vidro. O selo superior original da câmara foi descascado. Uma capa de vidro foi colocada na câmara de gravação. (E) Imagem bruta de um quadro do filme gravado. (F) Um quadro dividido (pixel por pixel) por uma imagem média em um filme. Observe que o fundo não uniforme na iluminação pode ser compensado por este processamento de imagem. (G) Paramécia extraído de um quadro usando a função "Análise de Partículas" em Fiji. (H) Exemplo de imagem em Fiji com um limiar aplicado. Paramecia parece brilhante, enquanto os olhos da larva de zebrafish parecem escuros, e o fundo é cinza. Podem ser calculadas alterações nas posições oculares (ou seja,ângulos em relação ao eixo corporal), se necessário. (I) Dados experimentais representativos do consumo de paramecium em uma larva de controle olfativo-bulbo-ablated (OB) e uma larva pretectum-ablated (PT). A ablação pré-detectum reduziu significativamente a capacidade de caça de presas, enquanto a ablação olfativa da lâmpada não afetou.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging