Prey Capture Assay: Une méthode pour étudier le comportement de capture des proies de larve de poisson zèbre

Overview

Cette vidéo décrit l’analyse de capture des proies. La vidéo traite de la méthode d’étude du comportement de capture des proies des larves de poisson zèbre après l’ablation au laser de neurones spécifiques.

Protocol

1. Évaluation des conséquences comportementales après ablation au laser

1. Mettre en place un système d’enregistrement comportemental qui se compose d’un stéréoscope équipé d’une caméra vidéo. Utilisez un appareil photo avec un logiciel d’acquisition d’image approprié, commercial ou sur mesure( Figure 1A).
2. Optimisez l’état d’éclairage afin que le paramécium puisse être détecté par le traitement d’image. Par exemple, utilisez une lumière LED blanche avec un espaceur (Figure 1B).
   Note: La distance et l’angle de la LED influe surl’apparence de l’échantillon (c.-à-d.lumineux en fond sombre ou sombre en arrière-plan lumineux) et sont donc essentiels au succès du traitement de l’image. Déterminez la meilleure hauteur de l’espaceur( Figure 1C).
3. Placer une larve de poisson zèbre (récupérée de l’expérience d’ablation au laser décrite dans la section 1) dans une chambre d’enregistrement comportementale (qui a été fixée à une glissière de verre) avec le joint supérieur d’origine enlevé (Figure 1D).
4. Recueillir 50 paramésie suspendues dans l’eau du bécher à l’aide d’une micropipette et les placer dans la chambre d’enregistrement.
5. Placez un bordereau de couverture sur le dessus de la chambre d’enregistrement. Placez une petite goutte d’eau sur le bordereau de couverture avant de le placer à la surface de l’eau de la chambre d’enregistrement pour éviter d’introduire de l’air dans la chambre.
   Note: Dans cette étape, un peu d’eau avec de la paramecia va déborder de la chambre d’enregistrement. Le nombre restant de paramécie dans la chambre d’enregistrement sera d’environ 30-40.
6. Placez la chambre d’enregistrement (contenant une larve et une paramecia)dans le système d’éclairage (Figure 1D).
7. Démarrez l’enregistrement en accéléré à 10 fps pendant 11 min (6 600 images).
8. (Facultatif) Pour chaque larve testée pour son comportement, observez la fluorescence des zones ablated au laser par microscopie fluorescente pour confirmer l’efficacité de l’ablation au laser(c.-à-d.absence, ou nombre considérablement réduit de cellules fluorescentes dans la zone irradiée au laser).
   Note: Même après l’irradiation, certaines cellules fluorescentes peuvent encore être observées en raison de l’apparition ultérieure de l’expression du gène Gal4 dans les cellules qui se sont différenciées après ablation.
9. Après avoir enregistré le comportement de la larve, pour compenser le manque d’uniformité en arrière-plan, effectuez une division pixel par pixel de chaque image par une image moyenne aux Fidji : cliquez sur « Processus », « Calculateur d’image », « Opération : Diviser », « 32 bits(float)result » et « OK ». Pour créer une image moyenne, cliquez sur « Image », « Stacks », « Z-Project », « Intensité moyenne » et « OK »(figure 1E, F).
10. Comptez le nombre de paramecia laissés dans la chambre en cliquant sur « Analyser », « Analyser les particules », définir une plage de zone qui couvre toute la paramécie,vérifier la case à cocher « Afficher: Masques », et en cliquant sur « OK ». L’option 'Show:Masks' fournira une image extraite de paramecia (Figure 1G), avec une liste du nombre de particules (paramecia) dans chaque image.
11. Tracez le nombre de paramecia laissés dans la chambre d’enregistrement au fil du temps. Étant donné que les estimations du nombre de paramecia sont bruyantes, nous vous recommandons d’effectuer une moyenne mobile sur chaque point dans une plage de 600 images (1 min) sur la feuille de calcul.

Representative Results

Figure 1. Les proies capturent l’analyse et les données représentatives des larves de poissons zèbres ablated au laser. (A) Système d’enregistrement comportemental. Le stéréomicroscope était équipé d’une caméra CMOS. Les images ont été acquises à l’aide d’un script sur mesure. (B) Composants du système d’éclairage. Un papier de couleur grise, un diffuseur en verre, une lumière blanche d’anneau de LED, un diffuseur, un espaceur sur mesure (carton), et diffuseur avec un trou au centre. (C) Le système d’éclairage assemblé à partir des pièces indiquées dans B. (D) Chambre d’enregistrement pour l’essai de capture des proies. Une chambre (diamètre : 20 mm; profondeur : 2,5 mm) a été placée sur une glissière en verre. Le joint supérieur original de la chambre a été épluché. Une couverture en verre a été mise sur la chambre d’enregistrement. (E) Image brute à partir d’un cadre du film enregistré. (F) Un cadre divisé (pixel par pixel) par une image moyenne dans un film. Notez que le fond non uniforme dans l’éclairage peut être compensé par ce traitement d’image. (G) Paramecia extrait d’un cadre en utilisant la fonction « Analyse des particules » aux Fidji. (H) Exemple d’image aux Fidji avec un seuil appliqué. Paramecia semblent lumineux, tandis que les yeux de la larve de poisson zèbre semblent sombres, et le fond est gris. Les changements de position des yeux(c.-à-d.les angles par rapport à l’axe du corps) peuvent être calculés, si nécessaire. (I) Données expérimentales représentatives de la consommation de paramécium dans une larve de commande olfactive-bulbe-ablated (OB) et une larve prétectum-ablated (PT). L’ablation prétectum réduisait considérablement la capacité de chasse aux proies tandis que l’ablation olfactive des bulbes ne l’affectait pas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging