תגובה לברוח Assay: שיטה ללמוד את התגובה של זחל זברה לגעת גירויים

Overview

סרטון זה מתאר את מבחני התגובה המעוררים מגע, המודדים את תגובת זחל הזברה למגע בגירויים.

Protocol

1. מבחני תגובה מעוררי מגע

1. הכנת 2 dpf עוברים לבדיקת תגובה מעוררת מגע
   1. ודא כי השעה ביום שבה הבדיקה מתבצעת היא עקבית בין ניסויים כי הפעילות יכולה להשתנות באופן דרמטי לאורך כל היום.
      הערה: הניסוי צריך להתבצע עיוור ואת סדר הבדיקות אקראי כדי למזער חפצים ניסיוניים.
   2. להקצות את זני הדגים מספר, אשר אינו ידוע לאדם המבצע את הניסוי. בעקבות זאת, שימוש בכלים מקוונים זמינים בחופשיות ליצור רשימה אקראית המכתיבה את סדר הבדיקה.
   3. לפחות שעה לפני הבדיקה, dechorionate עוברים על ידי קרע חור chorion בעדינות מושך את chorion לגזרים באמצעות זוג פינצטה בסדר. מוציאים את כל הפסולת מצלחת הפטרי לפני החזרה לאינקובטור 28 מעלות צלזיוס.
2. ביצוע מבחני תגובה מעוררי מגע
   1. שלב חום ל 28 °C (60 °F) לפחות 15 דקות לפני תחילת הבדיקה.
      הערה: שלב זה מבוקר טמפרטורה ויישאר ב 28 °C (69 °F) למשך הבדיקה. הטמפרטורה תשפיע על הפעילות ולכן חשוב לשמור על טמפרטורה קבועה. אם שלב מחומם אינו זמין אז הטמפרטורה של המים צריך להיות במעקב וכל הניסויים צריכים להתבצע באותה טמפרטורה.
   2. מניחים צלחת פטרי מלאה במדיום עוברי (5 מ"מ NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄ במים) על במה מוארת ולהרכיב את המצלמה במהירות גבוהה מעל צלחת פטרי.
   3. הפעל את תוכנת ההקלטה מצלמת וידאו (כגון זרם Pix 5, המתואר כאן) ותחת הכרטיסייה "סביבת עבודה" לבחור 1,000 מסגרת לשנייה (1,000 fps) כמו מהירות הלכידה כדי להבטיח כי פעולת שחייה מהירה של הדג נרשם.
   4. בעבודה עם עובר אחד בכל פעם, מניחים את העובר באמצע צלחת הפטרי עם דג הזברה גלוי בבירור בשדה הראייה.
      הערה: אם העובר שוחה משם לפני תחילת הניסוי להחליף אותו עם אחר, כמו כיבוש מחדש ומיקום של העובר עלול לגרום לו להיות חסר רגישות לגירוי ותגובות פרץ חוזרות ונשנות עשוי לקדם חולשת שרירים במודלים מסוימים של המחלה.
   5. התחל להקליט על ידי לחיצה על כפתור "שיא" ו, לספק את הגירוי mechanosensory לעובר על ידי נגיעה בו בעדינות עם מחט קהה על החלק העליון של הראש.
   6. עצור את ההקלטה לאחר שהעובר שחה מחוץ לשדה הראייה או חזר למנוחה.
      הערה: התאוצה מגיעה לשיאה בתוך 0.2 השניות הראשונות של תגובת הבריחה של פרץ בעקבות הגירוי המכני. לכן, ודא כי לפחות במהלך 0.2 השניות הראשונות של תגובת הבריחה הקלטת הדג נמצא בשדה הראייה. באמצעות התוכנה Stream Pix 5, הנתונים יישמרו באופן אוטומטי כקובץ וידאו .avi. תוכנה חלופית ללכידת וידאו כגון לכידת וידאו חינם או Softonic, שניהם זמינים בחופשיות להורדה, יכול לשמש גם.
   7. החזירו את העובר לצלחת פטרי חדשה ובחרו עובר אחר לבדיקה. בצע בדיקות על מינימום של 15 דגים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2