Ensaio de resposta de fuga: um método para estudar a resposta da larva de zebrafish para tocar estímulos

Overview

Este vídeo descreve o ensaio de resposta touch-evoke, que mede a resposta da larva de zebrafish para tocar estímulos.

Protocol

1. Ensaio de resposta evocado por toque

1. Preparação de 2 embriões dpf para ensaio de resposta evocado por toque
   1. Certifique-se de que a hora do dia em que o teste é realizado é consistente entre os experimentos, pois a atividade pode variar drasticamente ao longo do dia.
      NOTA: O experimento deve ser realizado cego e a ordem de testes randomizada para minimizar artefatos experimentais.
   2. Atribua aos peixes um número, o que é desconhecido para o indivíduo que realiza o experimento. A seguir, o uso de ferramentas on-line disponíveis gratuitamente gera uma lista aleatória que dita a ordem de teste.
   3. Pelo menos uma hora antes do teste, deschorionato embriões rasgando um buraco no acorde e puxando suavemente o acorde em separado usando um par de pinças finas. Remova os detritos da placa de petri antes de retornar à incubadora de 28 °C.
2. Executando ensaio de resposta evocado por toque
   1. Estágio de calor a 28 °C pelo menos 15 min antes de iniciar o teste.
      NOTA: Este estágio é controlado pela temperatura e permanecerá a 28 °C durante a duração do teste. A temperatura afetará a atividade e, portanto, é importante manter uma temperatura constante. Se um estágio aquecido não estiver disponível, a temperatura da água deve ser monitorada e todos os experimentos devem ser realizados na mesma temperatura.
   2. Coloque uma placa de petri cheia de embrião médio (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ na água) em um palco iluminado e monte a câmera de alta velocidade sobre a placa de petri.
   3. Inicie o software de gravação da câmera de vídeo (como o Stream Pix 5, descrito aqui) e sob a guia "espaço de trabalho" selecione 1.000 quadros por segundo (1.000 fps) como a velocidade de captura para garantir que a ação rápida de natação do peixe seja registrada.
   4. Trabalhando com um embrião de cada vez, coloque o embrião no meio da placa de petri com o zebrafish claramente visível no campo de visão.
      NOTA: Se o embrião nadar para longe antes do início do experimento substituí-lo por outro, pois a recaptura e o posicionamento do embrião podem resultar em sua dessensibilização ao estímulo e respostas repetidas de explosão podem promover fraqueza muscular em alguns modelos da doença.
   5. Comece a gravar clicando no botão "gravar" e, entregue o estímulo mecanosensorial ao embrião tocando-o suavemente com uma agulha cega na parte superior da cabeça.
   6. Pare a gravação depois que o embrião nadou para fora do campo de visão ou voltou a descansar.
      NOTA: Os picos de aceleração dentro dos primeiros 0,2 segundos da resposta de fuga de rajada após o estímulo mecânico. Portanto, certifique-se de que pelo menos durante os primeiros 0,2 segundos da resposta de fuga registrando o peixe está no campo de visão. Usando o software Stream Pix 5, os dados serão salvos automaticamente como um arquivo de vídeo .avi. Softwares alternativos de captura de vídeo, como Free Video Capture ou Softonic, ambos disponíveis gratuitamente para download, também podem ser usados.
   7. Devolva o embrião a uma nova placa de petri e selecione outro embrião para testes. Realizar testes em um mínimo de 15 peixes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2