Saggio di risposta alla fuga: un metodo per studiare la risposta della larva di zebrafish per toccare gli stimoli

Overview

Questo video descrive il saggio di risposta touch-evoke, che misura la risposta della larva di zebrafish per toccare gli stimoli.

Protocol

1. Test di risposta evocato dal tocco

1. Preparazione di 2 embrioni dpf per test di risposta evocati dal tocco
   1. Assicurarsi che l'ora del giorno in cui viene condotto il test sia coerente tra gli esperimenti perché l'attività può variare notevolmente durante il giorno.
      NOTA: L'esperimento deve essere eseguito accecato e l'ordine di prova casuale per ridurre al minimo gli artefatti sperimentali.
   2. Assegnare ai ceppi di pesce un numero, che è sconosciuto all'individuo che effettua l'esperimento. In seguito, l'utilizzo di strumenti online liberamente disponibili genera un elenco casuale che detta l'ordine dei test.
   3. Almeno un'ora prima del test, dechorionate embrioni strappando un buco nel corone e allontanando delicatamente il corone usando un paio di pinzette fini. Rimuovere eventuali detriti dalla piastra di Petri prima di tornare all'incubatore a 28 °C.
2. Esecuzione di test di risposta evocati dal tocco
   1. Stadio di calore a 28 °C almeno 15 minuti prima di iniziare il test.
      NOTA: Questa fase è a temperatura controllata e rimarrà a 28 °C per tutta la durata della prova. La temperatura influenzerà l'attività ed è quindi importante mantenere una temperatura costante. Se non è disponibile uno stadio riscaldato, la temperatura dell'acqua deve essere monitorata e tutti gli esperimenti devono essere condotti alla stessa temperatura.
   2. Posizionare una piastra di petri riempita con mezzo embrionale (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ in acqua) su uno stadio illuminato e montare la telecamera ad alta velocità sopra la piastra di Petri.
   3. Avviare il software di registrazione della videocamera (come Stream Pix 5, descritto qui) e nella scheda "workspace" selezionare 1.000 fotogrammi al secondo (1.000 fps) come velocità di acquisizione per garantire che l'azione di nuoto veloce del pesce sia registrata.
   4. Lavorando con un embrione alla volta, posizionare l'embrione al centro della piastra di Petri con il pesce zebra chiaramente visibile nel campo visivo.
      NOTA: Se l'embrione nuota via prima dell'inizio dell'esperimento, sostituirlo con un altro, poiché la riconquista e il posizionamento dell'embrione possono comportare che diventi desensibilizzato allo stimolo e risposte ripetute a raffica possono promuovere la debolezza muscolare in alcuni modelli di malattia.
   5. Inizia a registrare cliccando sul pulsante "registra" e, consegna lo stimolo meccanosensorie all'embrione toccandolo delicatamente con un ago smussato sulla parte superiore della testa.
   6. Interrompere la registrazione dopo che l'embrione è uscito dal campo visivo o è tornato a riposare.
      NOTA: I picchi di accelerazione entro i primi 0,2 secondi della risposta di fuga di scoppio a seguito dello stimolo meccanico. Pertanto, assicurarsi che almeno durante i primi 0,2 secondi della risposta di fuga che registra il pesce sia nel campo visivo. Utilizzando il software Stream Pix 5, i dati verranno salvati automaticamente come file .avi file video. Potrebbero essere utilizzati anche software alternativi di acquisizione video come Free Video Capture o Softonic, entrambi liberamente disponibili per il download.
   7. Riportare l'embrione in una nuova piastra di Petri e selezionare un altro embrione per il test. Eseguire test su un minimo di 15 pesci.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products	PT S90001
Tweezers, style 8	ProSciTech	T04-821
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
High Speed Camera	Baumer	HXC20
StreamPix5	NorPix		Step 1.2.3
Temperature Control Unit	Viewpoint
http://www.randomization.com	N/A		Steps 1.1.2